論文全稱：
High-resolution structural and functional deep brain imaging using adaptive optics three-photon microscopy

作者：

Lina Streich, Juan Carlos Boffi, Ling Wang等

發表期刊：Nature Methods

發表時間：2021年9月30日

重要發現
01三光子激發：突破組織散射的“光學鑰匙”
傳統雙光子顯微鏡（2PM）受限于表層離焦熒光干擾，在哺乳動物大腦中的成像深度僅約1毫米。三光子顯微鏡（3PM）通過長波長激發（1300nm）和非線性三光子吸收效應，顯著降低背景噪聲，將有效成像深度拓展至1.4毫米（小鼠海馬CA1區邊緣）。其核心優勢包括：

高信號背景比（SBR）：在深層組織中，3PM的SBR比2PM提升數倍，例如在皮層下900微米處可分辨單個突觸結構（直徑約0.5微米）。

低光損傷特性：通過優化激光參數（<50fs脈沖寬度、0.5–22mW平均功率），焦點能量控制在<2nJ，低于組織損傷閾值，可實現長時間活體觀測而不引發光毒性。

抗噪能力：即使在SBR極低的深層區域（如海馬>1毫米處），AO仍能通過神經元胞體信號完成像差校正，信號增強達8倍，軸向分辨率提升4倍。

大視場校正：軸向校正范圍覆蓋數百微米，允許在離優化點較遠的區域（如不同皮層層或海馬深層）維持高分辨率，無需依賴侵入性梯度折射率透鏡。

實驗顯示，AO校正后，皮層下900微米的突觸棘突和海馬1.4毫米處的樹突精細結構均清晰可辨，空間頻率分布恢復至理論衍射極限的90%以上。

03心電圖門控：凍結生理運動的“時間快門”
心臟搏動引發的腦組織微位移是深層成像的另一難題。研究團隊通過FPGA實時同步掃描與心電圖R波，在心跳峰值期間暫停成像，將幀間運動偽影降低60%，幀間相關性從0.94提升至0.98。

非侵入性優勢：無需植入傳感器或復雜后期處理，僅通過外部電極采集心電信號，適用于長期植入窗口的自由活動動物。

深度適用性：在海馬>1毫米深度，ECG門控使樹突成像的信噪比（SNR）提升3倍，允許通過幀平均進一步增強信號，而傳統非門控方法因偽影重疊無法實現。

白質纖維性星形膠質細胞：在胼胝體（深度862微米）觀測到微域鈣瞬變，盡管缺乏典型突觸接觸，仍表現出與神經元活動相關的功能性信號。

皮層深層原生質星形膠質細胞：在皮層V-VI層（深度835微米），AO校正后檢測到的鈣活性微域數量增加50%，揭示其對局部神經環路的動態調控潛力。

創新與亮點
01技術協同突破三大瓶頸

像差校正：傳統AO在深層低信號環境中效率不足，而模態-based AO通過全局波前調制，在信噪比比1還低的條件下仍能收斂，校正速度<500毫秒/模態。

運動偽影：ECG門控相比傳統事后校正更高效，掃描占空比僅降低40–60%，遠優于主動運動補償技術的復雜性。

03科學價值：從神經元到膠質細胞的解析
該技術首次在活體中清晰呈現深層神經元突觸可塑性（如皮層棘突動態變化）和膠質細胞功能異質性，為研究神經退行性疾病（如阿爾茨海默病的海馬突觸丟失）、脫髓鞘病變等提供了關鍵工具。例如，通過AO校正，可在海馬CA1區觀測到單個樹突棘的鈣信號，而傳統方法因像差模糊無法分辨。

總結與展望
三光子顯微鏡與自適應光學、心電門控的結合，標志著活體深層成像技術進入新紀元。其1.4毫米的穿透深度、亞微米級分辨率及非侵入性特性，使科學家得以窺視大腦“無人區”的神經活動細節，從神經元突觸到膠質細胞微域，全方位解析腦功能的細胞基礎。

未來，該技術有望通過波前整形技術與三光子的結合（如同時校正散射與像差），進一步提升成像深度至2毫米以上；微型化探頭的開發則可能實現自由活動動物的全腦實時成像。從基礎神經科學到臨床前研究，這項“光學革命”正推動我們向“解碼大腦”的終極目標邁出關鍵一步——或許在不久的將來，人類能借助這雙“光學慧眼”，真正揭開意識、記憶與疾病的神秘面紗。

DOI:10.1038/s41592-021-01257-6.