細(xì)胞外囊泡（EVs）是細(xì)胞釋放的納米級(jí)脂質(zhì)雙層結(jié)構(gòu)，攜帶蛋白質(zhì)、核酸等生物分子，在細(xì)胞間通訊和疾病發(fā)展中起關(guān)鍵作用。然而，傳統(tǒng)方法難以同時(shí)分析EVs的內(nèi)外蛋白。2022年發(fā)表在《ACS Sensors》的研究提出了一種名為EVPio的高通量多重分析技術(shù)，結(jié)合抗體微陣列和信號(hào)放大策略，成功實(shí)現(xiàn)了EVs內(nèi)外蛋白的同步檢測(cè)。該研究中，InnoScan 1100 AL共聚焦微陣列掃描儀作為核心檢測(cè)設(shè)備，為實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的獲取提供了重要支持。
 
技術(shù)原理與工作流程

EVPio技術(shù)的核心分為三個(gè)步驟：
2. 抗原修復(fù)（AR）與透化處理：優(yōu)化后的AR條件（90°C PBS處理1分鐘）打破了EVs內(nèi)部蛋白的交叉連接，使其能被抗體識(shí)別（圖2A）。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，AR處理后HSP90（內(nèi)蛋白）信號(hào)提升至51,000 RFU，而EGFR（外蛋白）信號(hào)保持相對(duì)穩(wěn)定。  
   
3. 多重檢測(cè)與信號(hào)放大：采用寡核苷酸條形碼標(biāo)記的檢測(cè)抗體和分支DNA擴(kuò)增技術(shù)（圖3，A，B, C）。其中，雙分支DNA樹（4個(gè)熒光基團(tuán)）的信噪比（SNR）與傳統(tǒng)的生物素-鏈霉親和素法相當(dāng)（圖3D）。    
InnoScan的作用：該掃描儀用于熒光信號(hào)的定量采集，通過多通道成像（如Alexa Fluor 488、Cy5等）解析不同蛋白的表達(dá)水平。HT29 EVs通過InnoScan三色熒光信號(hào)（Alexa Fluor 647、Cy3、Alexa Fluor 488nn）同步檢測(cè)HSP70、CD9和CD63。
 
關(guān)鍵數(shù)據(jù)與發(fā)現(xiàn)
研究以結(jié)直腸癌細(xì)胞（HT29和SW403）的EVs為模型，通過四種表面蛋白（EpCAM、CD9、CD63、CD81）捕獲EVs, 并檢測(cè)12種內(nèi)外蛋白的共表達(dá)模式（圖5）。
   
技術(shù)優(yōu)勢(shì)與局限性
EVPio 技術(shù)優(yōu)勢(shì)：
1.高通量：?jiǎn)螐埐Ｆ�可分�?6個(gè)樣本，12個(gè)指標(biāo)檢測(cè)。
2.靈敏度：分支DNA擴(kuò)增提升了低豐度內(nèi)蛋白的檢出限。
3.靈活性：寡核苷酸條形碼避免了抗體物種限制。 局限性：AR處理會(huì)降低外蛋白信號(hào)，需通進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)優(yōu)化。此外，Cy3通道易受背景干擾，建議改用近紅外熒光基團(tuán)。
 
總結(jié)與展望
EVPio技術(shù)通過整合抗體微陣列、InnoScan掃描儀和分支DNA擴(kuò)增，為EVs蛋白組學(xué)研究提供了新工具。未來可應(yīng)用于臨床樣本分析，例如通過EVs蛋白特征鑒定癌癥亞型。研究者計(jì)劃進(jìn)一步優(yōu)化抗原修復(fù)條件，并探索與測(cè)序技術(shù)的聯(lián)用，以提升多重檢測(cè)能力。
 
文獻(xiàn)原文鏈接：https://doi.org/10.1021/acssensors.2c01750