臺盼藍排除法目前得到美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）和歐洲藥品管理局（EMA）的認可，是細胞治療中總細胞數(shù)和細胞活力評估的標準。然而，隨著細胞治療的發(fā)展，對于復雜的細胞樣本如免疫細胞、原代細胞和干細胞，臺盼藍方法的局限性越來越明顯，其特點是高估了細胞活力、紅細胞污染等。
 

為了應對這些挑戰(zhàn)，基于熒光的細胞計數(shù)方法被引入。這些技術(shù)利用選擇性靶向細胞核的熒光染料，不受碎片或紅細胞的影響，確保細胞計數(shù)和活力評估更加精確。工業(yè)生產(chǎn)上迫切需要擴大基于熒光的自動細胞計數(shù)儀器的使用，以加快研發(fā)速度和生產(chǎn)效率。
 

意識到這些局限性，韓國食品藥品安全部（MFDS）更新了其細胞治療產(chǎn)品指南，支持使用帶有熒光核染色的自動細胞計數(shù)儀。NanoEnTek處于前沿，提供全系列先進的自動熒光細胞計數(shù)儀。
 

NanoEnTek 的產(chǎn)品系列包括 ADAM™ MC2/CellT 和ADAM™ MC Plus/CellT Plus。此外，NanoEnTek 還提供先進的 3 熒光通道細胞分析儀 ADAMII™ LS/CDx。對于需要高通量和高精度的用戶，NanoEnTek 的高通量雙熒光細胞計數(shù)儀EVE™ HT FL 脫穎而出，尤其適用于細胞治療研究和制造。有了這些先進的自動細胞計數(shù)儀，熒光細胞核染色方法為評估細胞治療過程中的細胞活力提供了更可靠、更高效的支撐。

1. 現(xiàn)行美國 FDA 和 EMA 指南
目前，美國 FDA 和 EMA 認可臺盼藍排除法（手動和自動）作為細胞治療質(zhì)量控制的標準方法。然而，這種方法具有局限性，使其不太適合復雜的細胞治療。例如，與基于熒光的方法相比，基于臺盼藍的活力往往高估了細胞活力，樣品中存在的紅細胞使總細胞計數(shù)不可靠，而基于臺盼藍的手動計數(shù)本質(zhì)上是主觀的，并且更具可變性。為了解決這個問題，監(jiān)管機構(gòu)已經(jīng)部分批準了基于熒光的細胞計數(shù)方法。

從工業(yè)角度來看，擴大基于熒光的自動細胞計數(shù)儀器的使用需求不斷增長。這樣做不僅可以加快研發(fā)過程，還可以提高生產(chǎn)效率。將批準范圍擴大到包括自動熒光細胞計數(shù)儀可以大大提高細胞治療生產(chǎn)的質(zhì)量和效率。

2. 傳統(tǒng)細胞計數(shù)的局限性：臺盼藍排除法
（1）臺盼藍排除法的定義
臺盼藍排除測定是測定細胞活力的最早和最常用的方法之一。臺盼藍（偶氮染料）染色機制背后的原理是基于細胞膜的差異通透性。

活細胞具有完整且功能性的細胞膜，可選擇性地允許某些分子通過。臺盼藍顆粒由于其大小和電荷，可以滲透到無活力細胞受損或受損的膜，進入細胞內(nèi)空間。

正常情況下，細胞內(nèi)環(huán)境尤其是細胞質(zhì)，由活躍的過程維持，例如在健康細胞的情況下，ATP 依賴性離子泵和轉(zhuǎn)運蛋白。這些細胞利用 ATP 能量，通過稱為胞吐作用的過程主動擠出臺盼藍顆粒，有效地從細胞內(nèi)空間去除染料并防止細胞被染色。

相反，無活力或死細胞缺乏產(chǎn)生 ATP 的能力，因此無法進行胞吐作用。結(jié)果，它們將臺盼藍染料保留在細胞質(zhì)中，導致它們在顯微鏡下呈現(xiàn)藍色或染色。

通過使用這種染色方法，研究人員可以直接識別和計數(shù)給定群體中的活細胞（未染色）和死細胞（藍色）。
 

（2）臺盼藍排除法的局限性
過去，基于細胞的研究主要利用永生化細胞系，例如 CHO 細胞。然而隨著細胞治療領(lǐng)域的發(fā)展，正在使用更復雜的樣本類型，包括原代細胞、外周血單核細胞（PBMC）、干細胞、解離的腫瘤細胞，甚至工程化的 T 細胞。這些細胞的大小、形狀和聚集特性各不相同，因此傳統(tǒng)的臺盼藍排除法在獲得準確結(jié)果方面并不完全可靠，尤其是對于 PBMC、干細胞和原代細胞等異質(zhì)性樣品。
 

以下是臺盼藍排除法的一些局限性：
 

首先，臺盼藍對哺乳動物細胞有毒。即使是活細胞最終也會被臺盼藍染色，因為有毒染料會滲透到細胞膜中，導致細胞在接觸后約 5 至 30 分鐘死亡。因此，必須在染料引入后 3 至 5 分鐘內(nèi)進行準確測量。此外，臺盼藍為致癌物，不僅對細胞有害，而且對人類有害，長期接觸后可能導致癌癥。

此外，臺盼藍可以將死細胞的形態(tài)改變，可能導致對活力的高估。用臺盼藍染色后，細胞立即開始破裂，成為彌漫性物體。臺盼藍染色后，一些死細胞可能會消失，導致總細胞計數(shù)不足，從而高估細胞活力。換句話說，臺盼藍的毒性會隨著時間的推移改變活力，從而影響測量準確性，從而導致低估細胞群活力。
 

這些不準確之處可能會影響細胞治療的結(jié)果，細胞治療依賴于對免疫細胞的準確測量，這些免疫細胞將被輸回患者體內(nèi)，此外，突出了對改進解決方案的需求，例如熒光細胞核染色法。

3. 細胞治療生產(chǎn)過程中熒光核染色方法的必要性
在細胞治療產(chǎn)品的生產(chǎn)中，從人體血液中提取各種免疫細胞。然而這些細胞經(jīng)常被紅細胞污染，當使用傳統(tǒng)的臺盼藍排除方法時，紅細胞可能會被錯誤地識別為死細胞。這種污染延伸到細胞碎片和非細胞顆粒，導致數(shù)據(jù)偏差。此外，在免疫細胞計數(shù)過程中，與 PBMC 混合的紅細胞無法區(qū)分，導致總細胞計數(shù)值不準確。這些不準確之處會顯著影響各種免疫細胞治療（如 CAR-T 和 NK 細胞治療）的研究、開發(fā)和生產(chǎn)，最終影響基于細胞的治療的整體質(zhì)量。

此外，與永生化細胞系相比，從血液、組織或器官中提取的原代細胞會帶來類似的問題，因為碎片的存在相對較高。這可能導致碎片被錯誤地計數(shù)為細胞，進一步加劇了總細胞計數(shù)的不準確性，并降低了基于細胞的療法的研究、開發(fā)、生產(chǎn)和制造的質(zhì)量。

此外，基于臺盼藍的細胞計數(shù)方法的局限性也延伸到其對細胞存活率的影響。總細胞計數(shù)值的不一致和不準確直接影響細胞活力評估。例如，在明場顯微鏡下檢查時，免疫細胞（如 PBMC）中豐富的細胞表現(xiàn)出更高的細胞活力變異系數(shù)（CV %），因為與傳統(tǒng)細胞系（>10μm）相比，它們的尺寸（8μm）更小。

與傳統(tǒng)細胞系不同，臺盼藍染色能夠區(qū)分活細胞（未染色）和死細胞（深藍色），根據(jù)內(nèi)部亮度確定 PBMC 等較小細胞的活力是一項重大挑戰(zhàn)。這一挑戰(zhàn)導致用戶之間存在顯著差異，并且使用傳統(tǒng)細胞計數(shù)顯微鏡區(qū)分活力的能力較差。

為了緩解這些問題，本司推薦具有細胞核熒光染色技術(shù)的自動細胞計數(shù)儀。這種方法包括對細胞核進行熒光染色，以獲得一致和準確的值，而與細胞大小無關(guān)。使用 PI 或 DAPI 等試劑根據(jù)染色細胞核的存在對死細胞進行計數(shù)，以確保準確性并最大限度地減少外部干擾。

該方法對永生化細胞系和從血液、組織或器官中提取的原代細胞均有效，即使存在碎片或紅細胞污染，也能提供一致且準確的結(jié)果。使用基于細胞核熒光染色的自動細胞計數(shù)方法可確保總細胞計數(shù)和活力測量的高精度和最小的外部干擾，從而實現(xiàn)可靠的數(shù)據(jù)采集并促進研究、開發(fā)和過程管理。

4. 韓國：主動修改“細胞治療產(chǎn)品放行測試指南”
韓國食品藥品安全部（MFDS）最近對其“細胞治療產(chǎn)品放行測試指南”進行了重大更新。此次更新是為了認可熒光核染色方法的準確性和可靠性。因此，使用這種方法的自動細胞計數(shù)儀現(xiàn)在被正式認可為有效的測試程序。

該指南的最新版本指出了臺盼藍染色方法的局限性，并正式認可了同時使用熒光細胞核染色法的自動細胞計數(shù)儀。這一發(fā)展是向前邁出的積極一步，它解決了與審批流程相關(guān)的問題，并為使用基于熒光的細胞計數(shù)儀進行更準確的細胞計數(shù)打開了大門。

隨著指南的修改，NanoEnTek 的自動熒光細胞計數(shù)儀系列包括ADAM™ MC2/CellT、ADAM™ MC Plus/CellT Plus、3 熒光通道細胞分析儀 ADAMII™ LS/CDx 和高通量自動雙熒光細胞計數(shù)儀 EVE™ HT FL，現(xiàn)在可以無縫集成到細胞治療產(chǎn)品的開發(fā)、制造、生產(chǎn)和臨床試驗中。這種基于熒光的細胞計數(shù)方法被認可為有效的檢測程序，可確保獲得準確可靠的數(shù)據(jù)，從而有助于細胞治療產(chǎn)品的整體質(zhì)量和安全性。
 

5. NanoEnTek 細胞計數(shù)儀：細胞治療開發(fā)和制造的理想工具
熒光細胞核染色方法在細胞治療產(chǎn)品的制造和質(zhì)量控制中以其高精度和可靠性而著稱。NanoEnTek 的自動熒光細胞計數(shù)儀系列，包括 ADAM™ MC2/CellT、ADAM™ MC Plus/CellT Plus 和 ADAMII™ LS/CDx，旨在為總細胞數(shù)量及其活力提供精確可靠的結(jié)果。

 

ADAM II 系列能夠使用細胞表面標志物 （CD marker） 進行準確的細胞識別和絕對計數(shù)。此外，EVE™ HT FL 是一款高通量熒光細胞計數(shù)儀，可在短短 3 分鐘內(nèi)處理多達 48 個樣品。這種卓越的精度和速度使 EVE™ HT FL 成為廣泛應用的理想選擇，包括細胞系和原代細胞的分析。
 

ADAM™ 系列、ADAMII™ 系列和 EVE™ HT FL 是非常適合用于細胞治療的設(shè)備。它們具有高準確性、可靠性和效率，使其成為細胞治療領(lǐng)域研究、開發(fā)和生產(chǎn)工藝不可或缺的工具。

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