細(xì)胞劃痕實驗的操作步驟及注意事項
實驗?zāi)康?/strong>
研究細(xì)胞的遷移能力，評估不同處理對細(xì)胞遷移的影響。
實驗材料與試劑
細(xì)胞株：口腔上皮癌細(xì)胞株
培養(yǎng)板：6孔板
DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶-EDTA溶液（用于細(xì)胞消化）、FBS（胎牛血清）、PBS緩沖液
移液槍頭（用于劃痕，建議10-20μl槍頭）
成像儀/顯微鏡（用于細(xì)胞成像）
實驗步驟
實驗前準(zhǔn)備
在6孔板背面使用水性筆畫5-7相互平行的直線（便于劃痕操作，以及觀察視野時定位）
細(xì)胞培養(yǎng)
將待測細(xì)胞接種于6孔板中，在37°C、5% CO₂的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。
細(xì)胞觀察
使用成像儀/顯微鏡觀察細(xì)胞，細(xì)胞融合度在80-90%，進行劃痕效果最佳。
劃痕處理
使用移液槍頭在細(xì)胞匯合的單層表面劃出多條直線，模擬“傷口”。注意保持劃痕一致，與水性筆畫的線相互垂直，避免細(xì)胞過多脫落。
清洗細(xì)胞
使用PBS緩沖液輕輕清洗細(xì)胞1-2次，去除脫落的細(xì)胞碎片，之后換上無血清培養(yǎng)基。
成像記錄
在0小時時，用成像儀/顯微鏡拍攝劃痕區(qū)域的圖像，記錄初始的劃痕寬度。
圖3
遷移監(jiān)測
將細(xì)胞置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。根據(jù)實驗設(shè)計，若使用顯微鏡則需分別在不同時間點（如6小時、12小時、24小時等）觀察并拍攝劃痕區(qū)域的細(xì)胞遷移情況。每個時間點要保持相同的拍攝條件和位置。
若使用成像儀，選好點位，設(shè)置好拍攝間隔時間與循環(huán)數(shù)即可（建議間隔時間2h，循環(huán)數(shù)24）。
數(shù)據(jù)分析
若用顯微鏡，需要使用圖像分析軟件（如ImageJ）來測量不同時間點劃痕的寬度，計算細(xì)胞遷移的距離或劃痕閉合率。根據(jù)實驗設(shè)計，評估不同處理條件下的細(xì)胞遷移情況。
若使用成像儀，通過STAT軟件自動生成劃痕曲線及相關(guān)數(shù)據(jù)：包括相關(guān)的劃痕定量曲線，自動給出傷口匯合度，相對傷口密度，傷口寬度等定量數(shù)據(jù)。
圖4 每1h拍攝一次后，通過成像儀得到的細(xì)胞生長曲線。
還可搭載選配的劃痕分析軟件，得到細(xì)胞遷移（劃痕實驗）實驗中自動生成劃痕曲線及相關(guān)數(shù)據(jù)：包括相關(guān)的劃痕定量曲線，傷口匯合度，相對傷口密度，傷口寬度等定量數(shù)據(jù)
圖5 劃痕選配軟件可以得到的更多更全面的定量數(shù)據(jù)
注意事項
劃痕操作要輕柔均勻，避免對細(xì)胞造成過度損傷。
劃痕后的清洗步驟要仔細(xì)，確保去除掉脫落的細(xì)胞碎片。
實驗過程中盡量減少培養(yǎng)板的移動，防止細(xì)胞位置變化影響結(jié)果。
每個條件需至少重復(fù)3個孔，以確保數(shù)據(jù)的可靠性和重復(fù)性。
預(yù)期結(jié)果
未處理組的劃痕會隨時間逐漸愈合，細(xì)胞向劃痕區(qū)域遷移，劃痕寬度逐漸減小。
處理組則根據(jù)處理的不同，可能出現(xiàn)細(xì)胞遷移加快或減慢的現(xiàn)象。
研究細(xì)胞的遷移能力，評估不同處理對細(xì)胞遷移的影響。
實驗材料與試劑
細(xì)胞株：口腔上皮癌細(xì)胞株
培養(yǎng)板：6孔板
DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶-EDTA溶液（用于細(xì)胞消化）、FBS（胎牛血清）、PBS緩沖液
移液槍頭（用于劃痕，建議10-20μl槍頭）
成像儀/顯微鏡（用于細(xì)胞成像）
實驗步驟
實驗前準(zhǔn)備
在6孔板背面使用水性筆畫5-7相互平行的直線（便于劃痕操作，以及觀察視野時定位）
細(xì)胞培養(yǎng)
將待測細(xì)胞接種于6孔板中，在37°C、5% CO₂的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。
細(xì)胞觀察
使用成像儀/顯微鏡觀察細(xì)胞，細(xì)胞融合度在80-90%，進行劃痕效果最佳。
圖1
劃痕處理
使用移液槍頭在細(xì)胞匯合的單層表面劃出多條直線，模擬“傷口”。注意保持劃痕一致，與水性筆畫的線相互垂直，避免細(xì)胞過多脫落。
清洗細(xì)胞
使用PBS緩沖液輕輕清洗細(xì)胞1-2次，去除脫落的細(xì)胞碎片，之后換上無血清培養(yǎng)基。
成像記錄
在0小時時，用成像儀/顯微鏡拍攝劃痕區(qū)域的圖像，記錄初始的劃痕寬度。
圖2
圖3
遷移監(jiān)測
將細(xì)胞置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。根據(jù)實驗設(shè)計，若使用顯微鏡則需分別在不同時間點（如6小時、12小時、24小時等）觀察并拍攝劃痕區(qū)域的細(xì)胞遷移情況。每個時間點要保持相同的拍攝條件和位置。
若使用成像儀，選好點位，設(shè)置好拍攝間隔時間與循環(huán)數(shù)即可（建議間隔時間2h，循環(huán)數(shù)24）。
數(shù)據(jù)分析
若用顯微鏡，需要使用圖像分析軟件（如ImageJ）來測量不同時間點劃痕的寬度，計算細(xì)胞遷移的距離或劃痕閉合率。根據(jù)實驗設(shè)計，評估不同處理條件下的細(xì)胞遷移情況。
若使用成像儀，通過STAT軟件自動生成劃痕曲線及相關(guān)數(shù)據(jù)：包括相關(guān)的劃痕定量曲線，自動給出傷口匯合度，相對傷口密度，傷口寬度等定量數(shù)據(jù)。
圖4 每1h拍攝一次后，通過成像儀得到的細(xì)胞生長曲線。
還可搭載選配的劃痕分析軟件，得到細(xì)胞遷移（劃痕實驗）實驗中自動生成劃痕曲線及相關(guān)數(shù)據(jù)：包括相關(guān)的劃痕定量曲線，傷口匯合度，相對傷口密度，傷口寬度等定量數(shù)據(jù)
圖5 劃痕選配軟件可以得到的更多更全面的定量數(shù)據(jù)
注意事項
劃痕操作要輕柔均勻，避免對細(xì)胞造成過度損傷。
劃痕后的清洗步驟要仔細(xì)，確保去除掉脫落的細(xì)胞碎片。
實驗過程中盡量減少培養(yǎng)板的移動，防止細(xì)胞位置變化影響結(jié)果。
每個條件需至少重復(fù)3個孔，以確保數(shù)據(jù)的可靠性和重復(fù)性。
預(yù)期結(jié)果
未處理組的劃痕會隨時間逐漸愈合，細(xì)胞向劃痕區(qū)域遷移，劃痕寬度逐漸減小。
處理組則根據(jù)處理的不同，可能出現(xiàn)細(xì)胞遷移加快或減慢的現(xiàn)象。
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