顯微成像應用：癌癥免疫學中的3D超多標成像（下）
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癌癥免疫學中的3D多標記成像可更好地表征組織變化和細胞相互作用。本文介紹了一種在STELLARIS 共聚焦平臺上進行3D成像的單次、超多標工作流程，用于小鼠腫瘤組織成像。通過優化成像設置和先進的拆分技術，我們準確地拆分了來自15種標記物的信號，實現了細胞類型和功能狀態的精確識別。這種方法為癌癥研究提供了全面的工具，有助于深入理解腫瘤微環境。
在成像時保持染料的光譜重疊盡可能低至關重要，但在如此高密度的多標記樣本中，串色無法完全避免。
在這種超多標水平上，拆分工具提供了一種識別和量化每個標記物貢獻的方法。
傳統方法中，單獨染色一個樣本（每個標記物一個）作為拆分的對照和起點。對照樣本中獲取的信息用于構建拆分矩陣。單染色方法比較繁瑣，因為這需要大量的樣本和精力，來創建與多重標記數量相同數量的樣本。
圖2：超多標實驗中創建對照數據的新策略。a–c,腫瘤對照樣品（頂部）分別對5種不同標記物進行了部分染色，創建了3組標記子集，以最小化串色可能的前提下涵蓋所需的15種染料對照（中間）。在成像工作流程中，對每組部分染色的樣本進行全通道采集（目標圖像，底部），這些圖像用于生成15標拆分矩陣。
由于樣本通常稀缺且難以獲得， SpectraPlex提供了一種便利的節省樣本的替代方案：不用準備一組單獨的單染色樣本，用戶會得到一組含有染料子集的對照樣本的制備建議。在我們的示例中，我們創建了一套三個組織切片，每個切片分別染色15標面板中的5個標記（即“Group”方法；圖2a–c，上方），并使用工作流程建議的設置進行成像。結果顯示出無串色的5通道模板，可構建拆分矩陣（圖2a–c，中間）。第二步，我們在同一視野內使用推薦設置對完整的15標通道進行成像（圖2a–c，下方）。這兩步的信息用于創建整體拆分矩陣。
圖3：小鼠胰腺腫瘤切片的3D 15標成像。a, 使用SpectraPlex功能對染色并拆分后的腫瘤切片進行成像的概覽。比例尺：500 µm。b–g, 從15標中提取的成像通道中的生物靶標細節，以便于展示。比例尺：50 µm。b, 淋巴細胞：B220（薄荷綠色）、CD4（青色）和CD8（黃色）。c, T細胞及抗原，解析其功能狀態：CD4（青色）、CD8（黃色）、PD1（紫色）、FoxP3（白色）和TCF1（棕褐色）。d, 髓系細胞：CD11b（天藍色）、CD11c（紅色）和MHC II（棕色）。e, 增殖細胞和基質抗原：Ki67 （深藍色）、α-SMA（橙色）和Tenascin C（森林綠色）。f, 癌上皮細胞和基質細胞功能狀態：E-鈣 黏蛋白（玫瑰色）和MHC I（綠色）。周圍的細胞外基質：Tenascin C（森林綠色）。g, 增殖細胞和成纖維細胞：Ki67（深藍色）和α-SMA（橙色）。血管內皮細胞：CD31（柑橘綠色）。
計算出拆分矩陣后，使用相應的設置對完整的15標樣本進行采集。拆分后的數據會自動生成（圖 3），并附上對應的原始圖像，方便后續分析和解釋。帶有所有生物相關通道的樣本片段展示了單輪染色方法的豐富信息（圖3a）。
癌癥樣本的詳細視圖展示了不同的微環境。例如，富含淋巴細胞的區域（B 和T細胞）展示了免疫系統在腫瘤中已經開始執行功能（圖3b）。這些淋巴細胞大多具備免疫功能，直接或間接抵抗腫瘤生長（圖3c中TCF1和PD1的表達），其中部分細胞還具有調節作用（圖3c中FoxP3的 表達）。髓系細胞在腫瘤中通常更為常見，功能各異，可發揮抗腫瘤或促腫瘤作用，其空間分布在很小尺度上呈現顯著差異（圖3d）。
樣本中的癌癥、基質和細胞外基質標記物表現出較高的異質性。雖然這些標記物的分布較為復雜（例如，成纖維細胞的細胞過程），但它們也明顯覆蓋了大片上皮和內皮細胞區域（圖3e–g）。高級拆分程序確保在組織內準確識別不同的細胞類型及其功能狀態（例如，免疫細胞亞型、組織決定因子和疾病決定因子）。
總體而言，建立一種穩健、快速且靈活的3D成像方法以評估癌癥組織對于解析腫瘤微環境的變化至關重要。該成像工作流程的高效性可以加速結果評估、決策制定，并為后續實驗設計提供有力支持。
一次性成像方法為此工作流程帶來了兩項關鍵優勢。首先，能夠對與癌癥標記物相關的感興趣區域（ROIs）進行深入探索，例如在不同放大倍數和更高分辨率下進行更詳細的空間特征分析。其次，所有標記物在三維環境中同時存在，確保在組織中發現的相互作用置于其預期或意料之外的組織微環境中進行分析。
總結
本研究展示了15種標記方法的成功應用，并為推動癌癥研究提供了重要的工具，能夠更好地表征腫瘤微環境中的免疫細胞類型和亞型、癌癥組織的免疫響應以及對潛在治療的反應。
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