肌張力障礙（dystonia）是一種常見的運動障礙，其特征是多個肌群出現不自主的持續肌肉收縮，表現為姿勢異常和動作紊亂。控制運動的神經回路分布在整個神經軸中，由多個相互連接的回路組成，涉及大腦皮層、基底神經節、丘腦、小腦、腦干和脊髓。這些回路協作后產生功能性運動和行為，當它們內部或之間出現功能異常時，就會導致運動障礙。

之前，肌張力障礙被認為是基底節綜合征中的一種，但當疾病發生時，人類或動物的基底節病變有限。因此，肌張力障礙目前被認為是一種涉及多個腦區的神經回路疾病。考慮到脊髓是運動控制的最終途徑，倫敦大學學院的研究人員試圖確定脊髓回路功能障礙在多大程度上引起了肌張力障礙的病理生理學。

倫敦大學學院皇后廣場神經病學研究所Robert M. Brownstone團隊構建DYT1-TOR1A肌張力障礙小鼠模型并開展研究，發現早發型全身性肌張力障礙的病理生理基礎在于脊髓神經回路。這項研究成果于近日發表在《Science Translational Medicine》（科學-轉化醫學）雜志上，為了解肌張力障礙的病理生理學提供了新視角。
 

圖片來源：《Science Translational Medicine》
（https://doi.org/10.1126/scitranslmed.adg3904）

研究材料與方法
研究人員將Tor1a-frt小鼠（由賽業生物提供）與Cdx2::FlpO小鼠雜交，構建了DYT1-TOR1A肌張力障礙小鼠模型。他們檢測了Tor1a在小鼠多個組織中的表達，并通過電鏡觀察了torsinA功能缺失的超微結構特征。之后，他們對小鼠開展了懸尾實驗和肌電圖分析，并對分離出的脊髓進行了體外電生理學分析，包括自發活動分析、單突觸反射分析和膜片鉗實驗等。

技術路線
01 開發脊髓限制性條件性敲除Tor1a小鼠模型并對其進行驗證
02 確定脊髓回路功能障礙是否會導致早發型全身性肌張力障礙
03 評估脊髓限制性的Tor1a敲除如何改變神經輸出
04 從單突觸反射入手評估脊髓回路功能障礙對疾病的病理生理學影響

研究結果
1.構建脊髓Tor1a d-cko小鼠模型
研究人員此次重點研究了肌張力障礙的最常見遺傳形式：早發型扭轉性肌張力障礙（DYT1-TOR1A），它通常是由TOR1A基因5號外顯子中三對堿基的框內缺失引起的，TOR1A基因編碼產生了內質網腔蛋白torsinA。于是，他們委托賽業生物構建出Tor1a-frt小鼠，并將其與Cdx2::FlpO小鼠雜交，產生了雙等位基因“雙”條件性敲除Tor1a小鼠（d-cko）。通過qPCR和Western blot分析，他們發現Tor1a在小鼠脊髓和背根神經節中幾乎沒有表達。

之后，他們篩選了torsinA功能異常的超微結構特征——核膜（NE）畸形。神經元中經典的torsinA表達分布在整個內質網和核膜中，但突變的torsinA會在核膜上異常積累。從形態上看，這會導致核外膜突起，而且這些突起以囊泡的形式釋放。他們通過電鏡觀察到，Tor1a缺失的腰部脊髓神經元充滿了核膜異常，后角處的部分神經元表現出囊泡堆積，且核膜明顯分離，而側角處的幾乎所有脊髓神經元都受到了影響。這些數據證實，這種新的小鼠模型將Tor1a d-cko限制在脊髓和背根神經節，且脊髓神經元表現出torsinA功能缺失的超微結構特征。

2.脊髓Tor1a d-cko小鼠重現了人類疾病的表型
為了驗證脊髓Tor1a d-cko小鼠模型是否會出現早發型扭轉性肌張力障礙，研究人員開展了一系列實驗。他們發現，脊髓Tor1a d-cko小鼠重現了人類重癥疾病的表型，出現了早發型扭轉性肌張力障礙。運動障礙很早就出現在小鼠后肢，之后逐漸向兩側擴散。到第7-9天，小鼠的骨盆、軀干和前肢都出現了明顯的運動障礙。到第19-21天，脊髓Tor1a d-cko小鼠出現了嚴重的肌張力障礙，姿態極度異常，肢體運動紊亂（圖1）。

通過肌電圖分析，他們觀察到脊髓Tor1a d-cko小鼠在靜止時有過度的自發肌肉活動，包括拮抗肌長時間的共活動電位。同時，這些小鼠在自主運動時表現出過度和無序的收縮。這些數據表明，脊髓限制性Tor1a功能障礙會直接造成早期發病的全身性肌張力障礙，其特征是靜止時持續的自發肌肉活動以及靜止和自主運動時過度的協同收縮。
 

脊髓限制性Tor1a d-cko導致小鼠出現早發型的運動失調^[1]

接下來，研究人員需要確定，Tor1a缺失的脊髓回路是否是過度自發活動和無序運動輸出的主要來源。考慮到后肢是脊髓Tor1a d-cko小鼠發病的主要部位，而腰椎是控制后肢運動的神經中樞，他們從小鼠身上分離出腰椎脊髓，并記錄了來自伸肌和屈肌相關脊髓運動池的電生理活動。他們發現，來自P3-P5脊髓Tor1a d-cko小鼠的所有離體脊髓都存在自發活動，在大部分自發活動中，伸肌相關和屈肌相關運動池共同激活（圖2）。這些結果表明，通過肌電圖記錄到的脊髓Tor1a d-cko小鼠的自發活動可能來自脊髓回路的自發活動。

為了確定脊髓Tor1a d-cko如何從根本上改變神經輸出，他們開展了小波變換（wavelet transformation）分析。P1期的脊髓Tor1a d-cko小鼠表現出高功率的頻譜，而P3期小鼠的頻譜出現紊亂，放電頻率下移，到了P5期，主要功率頻帶降至0.016 Hz（圖2）。這些數據揭示了Tor1a缺失的脊髓回路會直接在靜止時產生過度的自發活動，并在運動時產生無序的運動輸出。
 

Tor1a缺失的脊髓回路產生過度自發活動和無序運動輸出^[1]

3.脊髓Tor1a d-cko小鼠出現脊髓單突觸反射受損
考慮到脊髓回路出現功能障礙，研究人員接著驗證了最基本的脊髓回路：單突觸反射。病例報告顯示，全身性肌張力障礙患者表現出單突觸反射幅度減弱，因此，他們系統評估了脊髓Tor1a d-cko小鼠在P7到P13階段的腰神經根單突觸反射。結果顯示，這些小鼠最尾部的脊髓反射最早出現異常，隨著年齡的增加，單突觸脊髓反射損傷向小鼠頭部擴散。這些數據表明，在出生后的成熟過程中，單突觸脊髓反射損傷會從尾部向頭部發展。

之后，他們從該反射弧的四個組成部分入手，深入探索了單突觸反射受損的機制。他們重點研究了腰椎尾部運動池，因為它們最早受到影響。他們發現，脊髓Tor1a d-cko小鼠的運動神經元較小，全細胞電容降低，輸入電阻增加，表明腰部運動神經元直接受到Tor1a缺失的影響（圖3）。接下來，他們通過背根的低閾值刺激重點研究了傳入神經的反射。與對照組相比，這些小鼠的傳入誘發的興奮性突觸后電流（EPSC）振幅降低，持續時間延長，并出現多個異步峰值。總之，單突觸反射弧的所有部分，從感覺傳入的動作電位傳導到運動神經元再到運動神經根本身的傳出輸出，都容易受到Tor1a功能缺失的影響，并導致Tor1a d-cko小鼠的感覺運動整合功能受損。
 

脊髓限制性Tor1a d-cko導致小鼠出現早發型的運動失調^[1]

研究結論
總的來說，這項研究表明，脊髓回路功能障礙在DYT1-TOR1A肌張力障礙的病理生理學中發揮了關鍵作用。小鼠脊髓和背根神經節中Tor1a的缺失足以重現人類重癥患者的表型，且進一步分析顯示，脊髓運動回路和單突觸反射弧在Tor1a缺失后受損，表明脊髓神經回路的缺陷可能導致肌張力障礙的多個癥狀。

原文檢索：
[1]Pocratsky, A., Nascimento, F., Görkem Özyurt, M., et al. Pathophysiology of Dyt1-Tor1a dystonia in mice is mediated by spinal neural circuit dysfunction. Sci. Transl. Med. 15, eadg3904 (2023). https://doi.org/10.1126/scitranslmed.adg3904
 

Tor1a KO小鼠

品系名稱：
C57BL/6J-Tor1a^em1C/Cya
產品編號：
S-KO-18169
應用方向：
神經系統,眼科,皮膚,遺傳,癌癥,腸胃,代謝,內分泌,血液,肌肉

Tor1a flox小鼠