細(xì)胞傳代培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)步驟說(shuō)明
傳代培養(yǎng)中的細(xì)胞傳代培養(yǎng) (subculture)，當(dāng)原代培養(yǎng)成功以后，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)和細(xì)胞不斷分裂，一則細(xì)胞之間相互接觸而發(fā)生接觸性抑制，生長(zhǎng)速度減慢甚至停止; 另一方面也會(huì)因營(yíng)養(yǎng)物不足和代謝物積累而不利于生長(zhǎng)或發(fā)生中毒。當(dāng)培養(yǎng)的細(xì)胞增殖達(dá)到一定密度后，將會(huì)出現(xiàn)密度抑制現(xiàn)象，表現(xiàn)為細(xì)胞的生長(zhǎng)和分裂速度逐漸減慢，甚至停止。此時(shí)如果不及時(shí)進(jìn)行分裝再培養(yǎng)，即傳代培養(yǎng)，細(xì)胞將逐漸走向衰老、死亡。將培養(yǎng)的細(xì)胞從一個(gè)容器以 1∶2 或其他比率轉(zhuǎn)移到其他容器中擴(kuò)大培養(yǎng)，稱為傳代培養(yǎng)。貼附型生長(zhǎng)細(xì)胞采用酶消化傳代法，而懸浮型生長(zhǎng)細(xì)胞則采用直接傳代法或離心傳代法。
實(shí)驗(yàn)步驟:
一、貼附型生長(zhǎng)細(xì)胞的傳代貼附型生長(zhǎng)的細(xì)胞采用酶消化的方法進(jìn)行傳代。
具體步驟如下：
1. 細(xì)胞的清洗 取已長(zhǎng)成或接近長(zhǎng)成致密單層的 HeLa 或 T47D 細(xì)胞（或原代培養(yǎng)細(xì)胞）一瓶，倒去培養(yǎng)液，加入 2～3 mL Hanks 清洗液，輕輕振蕩漂洗細(xì)胞后傾去清洗液，以去除殘留的培養(yǎng)液和衰老脫落的細(xì)胞及其碎片。
2. 消化 加入適量（蓋滿細(xì)胞面即可）0.25% 胰蛋白酶溶液，室溫下（或 37℃）消化 2～3 分鐘后，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞面，待培養(yǎng)細(xì)胞變成圓形時(shí)即可快速倒去消化液（如消化程度不夠時(shí)可延長(zhǎng)時(shí)間）；再加 Hanks 清洗液輕輕清洗一遍后傾出或直接進(jìn)行下一步操作。如在酶消化過(guò)程中，見(jiàn)細(xì)胞大片脫落，表明消化過(guò)度，此時(shí)為避免細(xì)胞大量丟失，不應(yīng)倒去消化液，而要加入等量的培養(yǎng)液吹打，收集細(xì)胞，800r/min 離心 5 分鐘后棄去上清液，再進(jìn)入下一步。
3. 接種 在培養(yǎng)瓶中加入 3 mL 培養(yǎng)液（含 10% 血清）以終止消化。用吸管反復(fù)吹打瓶壁上的細(xì)胞層，直到全部細(xì)胞被沖下，輕輕吹打混勻，制成單細(xì)胞懸液。按 1∶2 或 1∶3 分配，接種到 2～3 個(gè)培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，再向各瓶補(bǔ)加培養(yǎng)液到 5 mL，也可以取細(xì)胞懸液計(jì)數(shù)，分別按需要的細(xì)胞濃度接種到一定數(shù)量其他的培養(yǎng)瓶中，再補(bǔ)足培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)。原代培養(yǎng)的細(xì)胞首次傳代時(shí)，細(xì)胞接種數(shù)量要多一些，以使細(xì)胞盡快適應(yīng)新環(huán)境，利于細(xì)胞生存和增殖，隨消化分離后的組織塊也可一并傳入新的培養(yǎng)瓶。
4. 觀察 細(xì)胞傳代后，每天應(yīng)對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行觀察，注意有無(wú)污染、培養(yǎng)液的顏色變化情況、細(xì)胞貼壁和生長(zhǎng)情況等，若細(xì)胞貼壁存活則稱為傳代一次。
二、懸浮型生長(zhǎng)細(xì)胞的傳代因懸浮型生長(zhǎng)細(xì)胞不貼壁，故傳代時(shí)不必采用酶消化法，而可直接傳代或離心收集細(xì)胞后傳代。
1、直接傳代
直接傳代即讓?xiě)腋〖?xì)胞慢慢沉淀在瓶底后，將上清液吸掉 1/2～2/3，然后用吸管吹打形成細(xì)胞懸液后再傳代。
2、離心傳代
（1）、在超凈臺(tái)內(nèi)用吸管將培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞吹打均勻，尤其是將半貼壁的細(xì)胞吹打起來(lái)。
（2）、將細(xì)胞懸液吸入離心管中，蓋緊膠蓋，與另一離心管配平后，置離心機(jī)中 800～1000r/min 離心 5 分鐘。
（3）、回到超凈臺(tái)操作，棄上清液，加入適量新培養(yǎng)液，用吸管吹打均勻，制成單細(xì)胞懸液。
（4）、按 1∶2 或 1∶3 分配傳代培養(yǎng)，也可以計(jì)數(shù)后根據(jù)所需要的細(xì)胞濃度傳至已準(zhǔn)備好的新培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿中，放入 CO2 培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。
實(shí)驗(yàn)步驟:
一、貼附型生長(zhǎng)細(xì)胞的傳代貼附型生長(zhǎng)的細(xì)胞采用酶消化的方法進(jìn)行傳代。
具體步驟如下：
1. 細(xì)胞的清洗 取已長(zhǎng)成或接近長(zhǎng)成致密單層的 HeLa 或 T47D 細(xì)胞（或原代培養(yǎng)細(xì)胞）一瓶，倒去培養(yǎng)液，加入 2～3 mL Hanks 清洗液，輕輕振蕩漂洗細(xì)胞后傾去清洗液，以去除殘留的培養(yǎng)液和衰老脫落的細(xì)胞及其碎片。
2. 消化 加入適量（蓋滿細(xì)胞面即可）0.25% 胰蛋白酶溶液，室溫下（或 37℃）消化 2～3 分鐘后，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞面，待培養(yǎng)細(xì)胞變成圓形時(shí)即可快速倒去消化液（如消化程度不夠時(shí)可延長(zhǎng)時(shí)間）；再加 Hanks 清洗液輕輕清洗一遍后傾出或直接進(jìn)行下一步操作。如在酶消化過(guò)程中，見(jiàn)細(xì)胞大片脫落，表明消化過(guò)度，此時(shí)為避免細(xì)胞大量丟失，不應(yīng)倒去消化液，而要加入等量的培養(yǎng)液吹打，收集細(xì)胞，800r/min 離心 5 分鐘后棄去上清液，再進(jìn)入下一步。
3. 接種 在培養(yǎng)瓶中加入 3 mL 培養(yǎng)液（含 10% 血清）以終止消化。用吸管反復(fù)吹打瓶壁上的細(xì)胞層，直到全部細(xì)胞被沖下，輕輕吹打混勻，制成單細(xì)胞懸液。按 1∶2 或 1∶3 分配，接種到 2～3 個(gè)培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，再向各瓶補(bǔ)加培養(yǎng)液到 5 mL，也可以取細(xì)胞懸液計(jì)數(shù)，分別按需要的細(xì)胞濃度接種到一定數(shù)量其他的培養(yǎng)瓶中，再補(bǔ)足培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)。原代培養(yǎng)的細(xì)胞首次傳代時(shí)，細(xì)胞接種數(shù)量要多一些，以使細(xì)胞盡快適應(yīng)新環(huán)境，利于細(xì)胞生存和增殖，隨消化分離后的組織塊也可一并傳入新的培養(yǎng)瓶。
4. 觀察 細(xì)胞傳代后，每天應(yīng)對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行觀察，注意有無(wú)污染、培養(yǎng)液的顏色變化情況、細(xì)胞貼壁和生長(zhǎng)情況等，若細(xì)胞貼壁存活則稱為傳代一次。
二、懸浮型生長(zhǎng)細(xì)胞的傳代因懸浮型生長(zhǎng)細(xì)胞不貼壁，故傳代時(shí)不必采用酶消化法，而可直接傳代或離心收集細(xì)胞后傳代。
1、直接傳代
直接傳代即讓?xiě)腋〖?xì)胞慢慢沉淀在瓶底后，將上清液吸掉 1/2～2/3，然后用吸管吹打形成細(xì)胞懸液后再傳代。
2、離心傳代
（1）、在超凈臺(tái)內(nèi)用吸管將培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞吹打均勻，尤其是將半貼壁的細(xì)胞吹打起來(lái)。
（2）、將細(xì)胞懸液吸入離心管中，蓋緊膠蓋，與另一離心管配平后，置離心機(jī)中 800～1000r/min 離心 5 分鐘。
（3）、回到超凈臺(tái)操作，棄上清液，加入適量新培養(yǎng)液，用吸管吹打均勻，制成單細(xì)胞懸液。
（4）、按 1∶2 或 1∶3 分配傳代培養(yǎng)，也可以計(jì)數(shù)后根據(jù)所需要的細(xì)胞濃度傳至已準(zhǔn)備好的新培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿中，放入 CO2 培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。
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