「訪談實錄」
LDLR位點基因突變引發動脈粥樣硬化
動脈粥樣硬化是一種慢性免疫代謝炎癥性疾病，臨床上被廣泛稱為“壞膽固醇”的低密度脂蛋白（LDL）升高在動脈粥樣硬化發展中發揮了關鍵作用。而炎癥反應、吸煙、高血壓和糖尿病則極大增加了該疾病發生的風險。

血漿中LDL的過量積累，激活了巨噬細胞參與，誘發血管內皮的慢性炎癥過程，巨噬細胞攝取LDL后，最終形成了所謂的“泡沫細胞”，該類細胞在斑塊內的聚集，不僅增加了動脈血管厚度與硬度，也引起血管內皮層功能障礙，促進了動脈粥樣硬化發展。如此炎癥環境也加劇了斑塊的不穩定性，增加了斑塊破裂的風險，最終誘發嚴重的心腦血管疾病，導致心肌梗死、缺血性中風，以及外周動脈等疾病。

家族性高膽固醇血癥（FH）被證實是低密度脂蛋白受體（LDLR）基因突變，導致LDLR缺乏，引起LDL升高等代謝異常的一種罕見遺傳病。FH患者體內LDL的過量積累，造成血管壁粥樣硬化性斑塊形成，導致血管狹窄、阻塞，從而誘發患者心肌梗死等心腦血管疾病。

通過發現臨床FH患者LDLR基因點突變的新位點，我們客戶周斌教授模擬人突變位點，借助CRISPR/Cas9技術，成功建立了Ldlr-E208X點突變小鼠模型，并證實該基因突變新位點，可引起小鼠包括總膽固醇、Ldl和甘油三酯等升高，以及主動脈弓斑塊形成等動脈炎粥樣硬化病變發生。且應用注射AAV9病毒肝特異性表達Ldlr的基因療法，實現小鼠體內Ldlr功能部分修復作用。

野生小鼠先天抵抗動脈粥樣硬化形成
動脈粥樣硬化相關小鼠模型的應用研究最早始于1960年代，通過給小鼠提供30%高脂肪、5%高膽固醇和2%膽酸飲食策略，成功誘導小鼠高膽固醇血癥發生，并觀察到不同血管部位脂肪條紋形成，也觀察到急性高強度炎癥反應的出現，但卻無法模擬人動脈粥樣硬化的那種慢性低強度的炎癥環境現象。

如果改用低毒性15%脂肪、1.25%膽固醇和0.5%膽酸飲食策略，在誘導3-9個月后，動脈粥樣硬化病變形成在不同小鼠品系中出現的差異性較大，卻以小鼠主動脈弓出現小范圍的脂肪條紋和無纖維化斑塊形成為特征。

基于單獨應用高脂肪飲食策略誘導存在的問題和相關病變出現差異等因素，使得只用飲食策略誘導野生小鼠發生動脈粥樣硬化變得非常困難。

需要提醒的是，由于小鼠本身的某些生理特征，決定了小鼠先天就對動脈粥樣硬化不易感。比如，1. 小鼠膽固醇組成中是以高密度脂蛋白（HDL）為主，LDL含量較低，使其總膽固醇含量維持在較低水平。而人則正好相反。2. 小鼠缺乏膽固醇酯轉移蛋白（CETP），人卻有該蛋白，該蛋白是促進膽固醇酯由HDL向極低密度脂蛋白（VLDL）轉運作用。3. 與人比較，小鼠腸道吸收膽固醇能力也較弱，導致小鼠內源性膽固醇合成增加。4. 小鼠能產生額外的α-和β-鼠膽酸，該鼠膽汁酸促進小鼠腸道排泄膽固醇；5. 小鼠APOE沒有其它變體亞型，而人APOE存在不同變體亞型，比如APOE2、E3和E4。

C57BL/6J小鼠是最常用的較易感動脈粥樣硬化小鼠品系
不同近交系小鼠品系對動脈粥樣硬化發生的易感性存在差異。實驗比較的十種近交系小鼠結果表明，C57BL/6J為最為常用較易感的動脈粥樣硬化品系小鼠。C57BL/6小鼠更容易誘發肥胖、糖尿病，以及炎癥損傷現象。

有比較研究表明，C57BL/6小鼠有相對較低的HDL，而BALB/c和C3H小鼠的HDL則相對較高。在誘導T細胞因子方面，C57BL/6小鼠主要誘導Th1 T細胞因子，特別是高水平的IFN-γ。Th1 T細胞可促進動脈粥樣硬化形成作用。而BALB/c小鼠誘導Th2 T細胞因子，產生較低水平的IFN-γ。

西方飲食誘導促進動脈粥樣硬化形成
為了加速動物粥樣硬化形成，多數情況下，實驗動物需要提供促動物粥樣硬化飲食，即典型的高脂肪和高膽固醇飲食，通常稱之為西方飲食。通常正常標準飲食（chow）含脂肪為4～6%，膽固醇為小于0.03%；而西方飲食則以模擬西方人每日飲食習慣為標準，即21%脂肪加上0.15%膽固醇的組合策略。

該種西方飲食不僅有明顯促進動脈粥樣硬化形成的作用，也常常被應用于誘導肥胖和代謝綜合癥小鼠模型實驗中。需要特別強調的是，短期提供高脂肪飲食，不僅可顯著影響到小鼠的免疫系統，也會影響腸道微生物。另外，還需要提醒的是，由于各種不同配方的西方飲食在不同實驗中應用中，因其關鍵成分來源差異，可能會影響到研究結果的重復性與可比性。

所以，是否應用西方飲食策略不是一個輕松簡單的選擇。一方面，該種飲食方式更接近該疾病患者的飲食生活習慣。另一方面，此種西方飲食也可能影響到某些細胞的一系列連鎖反應，從而增加了研究鑒別各種影響作用特征的復雜性與難度。盡管如此，在建立實驗標準化與縮短動脈粥樣硬化進程方面，應用西方飲食仍是非常有用的誘導策略。

Apoe敲除與Ldlr敲除小鼠為最常用動脈粥樣硬化小鼠模型
小鼠成為研究動脈粥樣硬化的主要動物模型是從1990年代開始，目前最為常用的動脈粥樣硬化小鼠模型為Apoe敲除（約占研究70%）和Ldlr敲除（約占27%）。

APOE為許多脂蛋白顆粒的結構糖蛋白，主要作為受體介導攝取的配體，在乳糜微粒和VLDL殘留清除方面發揮重要作用。雖然主要在肝和大腦合成，也可由單核細胞和巨噬細胞產生。

Apoe敲除小鼠于1992年成功構建，表現為血漿總膽固醇增高（主要為乳糜顆粒/VLDL）。用常規標準chow飲食，小鼠可出現復雜的動脈粥樣硬化病變，包括嚴重高膽固醇血癥與免疫調節功能的損害。血管病變主要位于主動脈弓和沿主動脈的不同分支點。如果用西方飲食策略，小鼠血漿總膽固醇水平，會比用常規普通Chow飲食，增加高出3倍以上。

Apoe敲除小鼠模型優勢為不需要西方飲食誘導，即可誘發小鼠出現明顯動脈粥樣硬化病變。然而，該模型特點是以VLDL作為血漿脂代謝主要成分，與人以LDL為主的脂代謝異常特征有一定差異。另外，APOE本身除了發揮介導脂蛋白清除作用外，也具有其它功能，比如抗氧化、抗增殖、抗炎癥等作用。因此，Apoe敲除小鼠引起的動脈粥樣硬化病變，可能不僅僅是依賴于血漿脂質水平的改變。

Ldlr敲除小鼠模型成功構建，在一定程度上，克服了Apoe敲除小鼠的不足之處。比如，與Apoe比較，Ldlr的功能作用相對單一。缺乏ldlr引起的動脈粥樣硬化，則更多與LDL脂蛋白穩態的改變密切相關。LDLR作為細胞表面受體，結合apoB100蛋白，參與介導LDL膽固醇的內吞作用，達到清除LDL目的。與APOE比較，人群中LDLR缺失更為常見，該基因突變是引起家族性高膽固醇血癥的致病原因。

Ldlr敲除小鼠于1993年構建成功，表現為血漿LDL膽固醇水平適度增加。用標準chow飲食時，小鼠要到12-15月齡時，才會出現明顯的動脈粥樣硬化病變。而用西方飲食誘導時，小鼠高膽固醇血癥明顯，且可出現大的動脈粥樣硬化斑塊。通常情況下，脂代謝與免疫系統損害不太明顯。因此，Ldlr敲除小鼠常采用高脂飲食誘導策略，以加速斑塊形成。

Ldlr敲除小鼠模型模擬了人家族性高膽固醇血癥臨床特征，包括主動脈瓣和主動脈根部損傷。另外，該模型也有助于探討動脈粥樣硬化與糖尿病之間的相互關系。有研究表明，與Apoe敲除小鼠比較，Ldlr敲除小鼠更易發生肥胖和胰島素耐受現象。

Ldlr敲除小鼠模型也不是完美的。由于需要用西方飲食以加速動脈粥樣硬化形成，而高膽固醇飲食誘導策略增加了實驗結果的可變性，使得不同實驗室結果進行標準化比較的難度也大大增加了。

Apoe敲除與Ldlr敲除小鼠模型比較
前面說過APOE基因的多功能特征，比如不僅具有脂蛋白轉移功能，也在其他方面（如血腦屏障的形成、血管功能、以及重要的免疫調節等）都發揮了一定作用。缺乏AOPE可能導致膽固醇轉移紊亂，細胞增殖增加，以及全身性白細胞增多等。

與Ldlr敲除小鼠比較，Apoe敲除小鼠因呈現更高的炎癥反應水平，故也展現更多且明顯的表型。Ldlr敲除小鼠中則呈現較弱脂代謝異常和免疫系統方面表型，這也許可被認為是該模型的某種優勢。但是，Ldlr敲除小鼠更不容易發生損傷誘導的新生內膜形成。所以，Apoe敲除小鼠在研究血管成形術后潛在的再狹窄分子機制方面，仍然是一個更好的模型選擇。

用標準chow飲食時，Apoe敲除小鼠比Ldlr敲除小鼠更快出現明顯表型。因此，Apoe敲除小鼠模型實際應用中，不需要考慮不同飲食喂養干預的復合影響因素。但我們也需要清醒認識到，Apoe敲除小鼠不需要高脂飲食來誘發動脈粥樣硬化斑塊形成，但人的動脈粥樣硬化發展卻是與西方飲食習慣密切相關。單基因突變的家族性高膽固醇血癥與LDLR基因突變相關性在人群中為1/200比例，雖然APOE突變也存在于一定人群中，比例卻相對較低。但兩種小鼠模型都被認為與人疾病密切相關。

考慮到高脂肪高碳水化物（富含葡萄糖或蔗糖）飲食方式，也是誘導C57BL/6小鼠肥胖和II型糖尿病（T2D）小鼠模型常用方法。研究表明，在該類飲食誘導策略下，Ldlr敲除小鼠較Apoe敲除和野生型小鼠更易發生T2D。所以，該兩種敲除小鼠模型有助于揭示與動脈粥樣硬化相關的代謝合并癥。然而，不同實驗室間在誘導特定疾病模型的實際研究中，由于飲食組成及誘導策略的易變性，使得相關實驗結果的可比性與可重復性成為一種挑戰。

雖然兩種敲除小鼠都對鏈脲霉素（STZ）誘導糖尿病表型發生敏感，有報道表明，經STZ處理的Apoe敲除小鼠，與STZ處理的Ldlr敲除小鼠比較，有明顯促進動脈粥樣硬化發生作用。提示APOE具有抵消糖尿病介導的危險作用。另外，研究也表明，這兩種敲除小鼠除了有脂蛋白轉移功能方面的缺陷外，也都表現一些其它代謝性和行為學方面的異常。

Apoe敲除和Ldlr敲除小鼠與其他小鼠模型的聯合應用
這兩種敲除小鼠都有與其他相關小鼠交配，以研究代謝相關疾病的報道。比如，與Akita小鼠模型交配，因該小鼠存在胰島素編碼基因Ins2突變，導致胰島素蛋白折疊錯誤，引起beta細胞程序性死亡增加。與Akita小鼠交配后，這兩種敲除小鼠表現更加顯著血管炎癥和動脈粥樣硬化表型，特別是雄性小鼠。這可能與雄性Akita小鼠的遺傳背景影響其血壓及其腎臟損傷有關。

這兩種敲除小鼠分別與相關肥胖小鼠交配，比如ob/ob和db/db小鼠，以探討實驗性動脈粥樣硬化發展過程中，代謝綜合癥相關因素的影響。結果發現，Apoe和Ldlr敲除小鼠均出現肥胖、高脂血癥和T2D，即使用標準chow飲食，隨后也觀察到高膽固醇血癥及動脈粥樣硬化病變加速形成。

ApoE*3‑Leiden轉基因小鼠和SRB‑1/Apoe雙基因敲除小鼠也應用許多研究。用西方飲食誘導，ApoE*3‑Leiden小鼠模型可出現嚴重高膽固醇血癥。如果與人CETP轉基因小鼠交配，表現更接近人脂蛋白膽固醇分布情況。Apoe^-/-; Fbn1C1039G^+/‑雙基因敲除小鼠模型則表現為易損的動脈粥樣硬化斑塊形成，導致斑塊更易破裂發生。該模型為研究人不穩定性斑塊特征提供了工具。

考慮到血脂異常合并癥，此兩種敲除小鼠模型也被應用于研究非酒精性脂肪性肝炎誘發易感性。非酒精性脂肪性肝炎是一種表現為肝脂肪變性、炎癥、肝損傷和肝纖維化等特征的疾病過程。相對于Apoe敲除小鼠，Ldlr敲除小鼠具有增加肝臟炎癥反應、程序性死亡和肝纖維化等發生的作用。

誘導高脂血癥小鼠模型的新策略
PCSK9基因功能獲得性突變（gain of function）特征在人群中的發現，不僅有益于開發治療心血管疾病的新方法（比如PCSK9抑制劑），也為建立高膽固醇血癥小鼠模型提供了新策略。PCSK9基因在肝臟高表達，存在于血循環中，與LDLR結合后，促進LDLR的降解，從而介導高膽固醇血癥。而PCSK9功能性缺失突變體D374Y（DY）則具有抑制其正常功能的作用。因此，通過表達人PCSK9-DY突變體來建立動脈粥樣硬化小鼠模型的優勢在于，無需進行小鼠生殖細胞相關編輯，因而降低了小鼠模型構建的技術門檻與成本。

借助腺相關病毒（AAV）尾靜脈注射方法，建立長期肝表達人PCSK9-DY突變體小鼠模型表明，用標準chow飲食，小鼠膽固醇水平適度增加。而用西方飲食誘導策略，PCSK9 DY-AAV小鼠加劇的高脂血癥與明顯血管病變形成。除了觀察到有巨噬細胞侵潤和纖維化組織形成外，還伴有泡沫細胞和平滑肌細胞的存在，小鼠主動脈根病變以晚期斑塊形成為特征。

我們客戶梁思佳教授應用AAV8表達人PCSK9-DY突變體，經尾靜脈注射至NFATc3巨噬細胞特異性敲除小鼠的研究證實，NFATc3基因在巨噬細胞中的缺失，加速了PCSK9-DY誘導動脈粥樣硬化病變的形成與發展。

動脈粥樣硬化小鼠模型的局限性及其影響因素
應用小鼠模型建立動脈粥樣硬化形成的局限性，除了前面描述的小鼠先天抵抗動脈粥樣硬化發生的某些特征外，也表現在下面幾個方面，1. 小鼠冠狀動脈太小，不易觀察到，收集血液也比較困難。2. 考慮到小鼠與人在心血管系統解剖方面的不同差異，小鼠動脈內膜組成只含有內彈性層上的內皮細胞，且血管中膜也更薄且無血管滋養管；而人則含有平滑肌細胞或結締組織和血管滋養管等。3. 小鼠模型觀察的動脈粥樣硬化病變形態學不同于人，比如小鼠無厚纖維帽形態出現。4. 小鼠動脈粥樣硬化病變部位為主動脈和頸動脈，而人則發生在冠狀動脈。5. 小鼠模型很少見非穩定斑塊現象，即很少發生斑塊病變破裂，而這是導致人急性梗塞發生，誘發心血管疾病死亡的主要直接原因。

關于小鼠斑塊病變很少破裂發生的現象，有研究者認為，在多數小鼠模型研究的有限觀察范圍時期內，要想發現動脈粥樣硬化血栓形成的情況是很難的。有最新研究表明，如果對高膽固醇血癥小鼠模型進行較長時間的實驗觀察，可在小鼠冠狀動脈觀察到動脈粥樣硬化血栓形成的跡象。所以，那種認為動脈粥樣硬化小鼠模型不能表現斑塊破裂、心肌梗死和缺血性中風等表型是某種誤解。然而，需要承認的是，在模擬人斑塊病變破裂方面，動脈粥樣硬化小鼠模型中斑塊病變部位的不同分布與生物力學等特性方面，并非為最優模型選擇。

另外，我們也需要明白的是，動脈粥樣硬化小鼠模型應用研究的結果，也會受到如下許多因素的影響。1. 小鼠遺傳背景，比如C57BL/6J表型較Balb/c、129/J和FVB等都更加明顯。2. 研究關注點差異，小鼠模型多數研究只關注病變損傷區域大小，而忽略其他相關因素，比如單核白細胞、平滑肌細胞、淋巴細胞、鈣化沉積物、膠原蛋白和壞死細胞碎片等。3. 性別因素，通常見雌性小鼠病變嚴重，而人則是男性患者更嚴重；4. 研究策略，多為基因全身敲除或高脂飲食誘導，導致從多基因與信號通路收到影響，可能引起旁路方式而非直接作用效果；5. 其它可變因素，不同小鼠模型、研究方法與技術、飼料/飲食組成、研究時間長短、鼠齡、飼養環境，以及小鼠研究數量等。

「專家簡介」

俞曉峰博士
賽業生物中國區副總裁兼首席科學家

軍事醫學科學院博士，國際知名模式動物和細胞生物學專家，耶魯大學醫學院和紐約大學醫學院研究員，美國基因打靶公司（iTL）和應用干細胞公司（ASC）資深科學家。在基因修飾模式動物領域有超過20多年研發與管理等方面的豐富經驗，在干細胞相關領域及哺乳動物細胞系基因改造研究也取得了巨大成就，其研究成果多次發表在Nat Immunol、Hum Mol Genet、Mol Cell Biol等高水平雜志上。

小鼠模型相關參考資料：
[1]【技術連載】俞曉峰：Cre-loxP位點特異性重組系統在小鼠條件性靶基因功能研究中的應⽤，2021-10-1，生物通
[2]【專訪】俞曉峰：小鼠疾病模型構建與藥物臨床前評價研究的思考，2021-5-10，中國實驗動物信息網
[3]【專訪】俞曉峰：小鼠模型在人冠狀病毒感染性疾病中的應⽤研究，2020-3-20，中國實驗動物信息網
[4]【專家分享】俞曉峰:人源抗體基因小鼠研發及其在治療疾病中的應用，2020-7-13，丁香園
[5]【專訪】俞曉峰：無菌小鼠及腸道微生物移植小鼠模型在⼈相關疾病研究中的應⽤，2019-9-09，中國實驗動物信息網
[6]【專訪】俞曉峰：人源化基因修飾小鼠模型的研制及其應⽤進展，2018-10-30，中國實驗動物信息網
[7]【專訪】俞曉峰：人源化小鼠模型在人類疾病研究中的應⽤，2018-4-19，中國實驗動物信息網