保存溫度
-20℃ 避光保存

有效期
一年

檢測方法
流式細胞儀/熒光顯微鏡 /激光共聚焦

適用樣本
細胞

產品應用
流式細胞儀/熒光顯微鏡 /激光共聚焦

儀器準備
流式細胞儀/熒光顯微鏡/激光共聚焦 、 離心機、移液器 、冰箱、 冰盒

試劑準備
PBS緩沖液  或者HBSS

耗材準備
離心管、 吸頭 、 一次性手套

使用注意事項
螺旋蓋微量試劑管裝的試劑在開蓋前請短暫離心，將蓋內壁上的液體收集至管底，避免開蓋時液體灑落。細胞處理需要小心操作,盡量避免人為的損傷細胞。 試劑A為DMSO溶液，冬季氣溫較低時在室溫時為凝固狀態，極易粘附在管壁、吸頭壁。注意需要加熱溶解，吸頭也需要放在培養箱預熱，否者容易再次凝固在吸頭內壁產生損耗。融解后離心至管底部再打開螺旋蓋。  試劑A為了便于觀察防止誤操作導致損失，在試劑盒中時是采用透明管包裝，收到后可以離心移入干燥黑色避光密封管或者用鋁箔包裹避光。 由于Calcein-AM的穩定性比較差，染色工作液必須現配現用，并且在當天用完。

alcein-AM對濕度非常敏感，若是Calcein-AM溶液每次取完需要量后，必須緊緊密封蓋子。建議根據單次用量，分裝密封保存。不可使用含水的吸頭。  試劑A母液請擰緊螺旋蓋，避免受潮失效。  染色液A為DMSO溶液，冬季氣溫較低時在室溫時為凝固狀態，極易粘附在管壁、吸頭壁。注意需要加熱溶解，吸頭也需要放在培養箱預熱，否者容易再次凝固在吸頭內壁產生損耗。  以下實驗步驟僅供參考，以實際的樣本和文獻參考步驟進行調整�？梢匀旧珣腋∨囵B細胞、貼壁細胞、制備的細胞爬片、涂片等原位染色。

使用方法
1. 染色工作液的配制： 根據樣品數按下列比例配制染色工作液。 用染料稀釋液試劑C將染色液A和B分別10倍稀釋。 每10ml HBSS緩沖液或無血清培養基中加入100μl稀釋過的染色液A，充分混勻，即成染色工作液A。 每10ml HBSS緩沖液或無血清培養基中加入20-200μl稀釋過的染色液B，充分混勻，即成染色工作液B。
2. 收集樣本細胞。
【注】：根據下游檢測儀器和應用需要，貼壁細胞時,可以先用胰酶-EDTA等消化細胞，制備成細胞懸液。也可以直接原位染色檢測。
3. 用PBS洗滌細胞兩次。
【注】：由于培養基中的血清等含有酯酶，導致Calcein-AM遇水會分解，會導致空白上升，所以需要用PBS洗滌數次直到完全洗凈。  貼壁細胞可以原位染色，注意吸除培養基前用培養板離心機離心，防止丟掉漂浮的死細胞。PBS洗滌時也需要離心培養板。
4. 用200μl染色工作液A將細胞重懸。
【注】： Calcein-AM溶液和EthD-I溶液分開進行染色，先用Calcein-AM染色，再用EthD-I染色。  有時候可添加一定量的非離子表面活性劑如Pluronic F127到Calcein AM內來增強其水溶性。制備染色工作液前，取一管需要用的Calcein AM內加入20% Pluronic F127，使Pluronic F127的終濃度為0.02%。  含Pluronic F127的Calcein AM溶液不可長期保存，現配現用。
5. 在室溫或37℃避光孵育15-20分鐘。
6. 用PBS洗滌細胞。 【注】： 如有必要，使用含有陰離子轉運抑制劑的緩沖液來進行細胞清洗。
7. 用200μl染色工作液B將細胞重懸。
8. 在室溫或37℃避光孵育2-5分鐘。
9. 用PBS洗滌細胞。
10. 用適量PBS重懸細胞。
11. 用熒光顯微鏡或流式細胞儀檢測結果。最大激發為490nm，最大發射波長為515nm和617nm。 結果分析 ： 熒光顯微鏡下，使用490±10nm波長激發，活細胞為黃綠色，死細胞為紅色。 用528 nm波長激發，能夠看到紅色的死細胞。

常見問題分析
所有細胞都染上紅色？ EthD-3濃度過高會導致活細胞也被染色，需要優化EthD-3的使用濃度，稀釋至僅對死細胞核染色，而不會對細胞質染色的最佳工作濃度。  細胞被同時染上綠色和紅色？ 樣本中有大量晚期凋亡細胞時，細胞胞漿會有Calcein著色并呈碎片狀，而且EthD-I也為陽性。