牙齒是我們最最親密的老友，幾乎陪伴我們一生。它是人體里最堅硬的器官，幫助我們把食物切碎、研磨，在吞咽食物前將食物加工成更適合胃消化的大小和狀態，從而讓我們更好的吸收食物中的營養，保持健康。雖然它很“強硬”，但也有“脆弱”的一面，由于牙髓內含有豐富的感覺神經末梢，當牙齒遭遇危機時，可能會引起劇烈的疼痛，所以人們常說：“牙疼不是病，疼起來真要命。”

健康從“齒”開始，請呵護牙齒健康，關注牙齒的重要寶藏資源——牙髓干細胞。
 

牙齒與DPMSCs

牙齒的構造從上到下主要分為牙冠、牙頸、牙根，從外到內主要分為牙釉質、牙本質、牙髓，其中牙髓外部為一層造牙本質細胞，內部還有神經、血管，淋巴和結締組織，正是因為牙髓組織的這種構造，使我們的牙齒在遭受到外界過冷、過熱、外力損傷、壓力刺激等不利于身體正常生理活動的情況下，能迅速預警傳遞給大腦從而發生反應；當牙齒受損時，牙髓內部還存有一種可隨時待命的間充質干細胞，他會分化為損傷組織細胞從而修復損傷，或通過分泌多種因子促進傷口愈合降低炎癥反應等等。

這種牙髓來源的間充質干細胞在2000年，由Gronthos等科學家發現并分離出來，他與骨髓間充質干細胞有非常相似的表面標記物，及形成礦化結節的能力，科學家根據他的來源命名為牙髓間充質干細胞(Dental Pulp Mesenchymal Stem Cells, DPMSCs)。

我們每個人都有牙齒，牙髓間充質干細胞的來源獲取十分便利，沒有倫理爭議，且他作為間充質干細胞本身的干性和作用也毫不遜色，在牙齒及頜骨組織的再生修復、口腔以外組織的再生修復、免疫調節等多種治療中具有廣闊前景。
 

人下頜第一磨牙(a–c)和人股骨(d, e)以及牙髓結構(f)之間的對比       
 

DPMSCs分離培養

材料準備

• 樣本：兒童乳牙或成人智齒，采集時間＜12小時，樣本保存液：基礎培養基+1%雙抗10mL，保存溫度4℃。

• 試劑：OriCell^®PBS、OriCell^®人牙髓間充質干細胞完全培養基、OriCell^®Collagenase Type I (0.1%) 一型膠原蛋白酶、OriCell^®胰蛋白酶細胞消化液（0.25%）、中性蛋白酶。

• 耗材：50mL無菌采集瓶一個、50mL離心管5-10個、10mL移液管4個、T25培養瓶若干個。

• 器械：小型手持打磨機、配小齒輪、拔髓針一套（含多種型號）、牙鉗、止血鉗、眼科剪。
   

牙髓組織獲取

1.1 取兒童乳牙或成年阻生智齒，用小型手持打磨機配滅菌小齒輪在培養皿中縱向或橫向將牙冠切掉，用拔髓針取出牙髓組織。

1.2 將取出的牙髓組織放入1.5mL ep管中。用OriCell^®PBS潤洗培養皿2-3次，收集潤洗液，轉移進1.5mL ep管中。

牙髓組織消化

2.1 用眼科剪適當剪碎牙髓組織，消化液配制終濃度為膠原酶Ⅰ型（3mg/mL）：中性蛋白酶（4mg/mL）=1:1；使用1-2倍體積的消化液與牙髓組織混勻，置于搖床37℃消化1小時。

2.2 輕輕吹打組織塊，使細胞離散成單個細胞懸液。OriCell^®PBS洗滌1-2遍，挑出沒有消化掉的組織放入T25培養瓶底部貼壁靜置，細胞懸液室溫250×g，6min離心，去上清。

2.3 用OriCell^®人牙髓間充質干細胞完全培養基3mL重懸細胞，輕輕接種于裝有牙髓組織塊的T25培養瓶中，盡量不要使已貼壁的組織塊漂浮起來，將培養瓶放入培養箱中37℃，5%CO₂條件培養。24h后觀察細胞，看細胞是否有貼壁和污染現象。

換液操作

2.4. 原代接種第3天進行第一次半量換液。

2.5. 輕輕將培養瓶中的培養基倒入50mL離心管中，250×g，6min離心。

2.6. T25培養瓶中加入離心完畢的1.5mL舊培養基，1.5mL新OriCell^®人牙髓間充質干細胞完全培養基，半量換液完畢。

2.7. 將培養瓶放入37℃、5%CO₂、飽和濕度的CO₂培養箱中。

2.8. 完成第一次換液后每隔3天進行一次半量換液(可以根據生長情況適當調整)，半換液直到細胞匯合度達到可傳代為止。

傳代培養

（P0傳P1與P1后傳代的操作方法流程一致）

2.9. 將完全培養基、PBS、胰酶預熱至37℃。

3.0. 吸去培養容器中的培養基。用OriCell^®PBS(T25培養瓶加入約3mL，T25培養瓶加入約3mL)洗滌細胞2次，注意動作輕柔，清洗全面。吸去PBS。

3.1. 加入OriCell^®胰酶(T25培養瓶加入約1.5 mL，T75培養瓶加入約3mL)，迅速鋪勻，保證充分接觸細胞表面。

3.2. 顯微鏡下觀察消化情況，約70%~80%細胞收縮變圓后，輕拍培養容器外壁，使細胞脫離培養表面。立即加入OriCell^®人牙髓間充質干細胞完全培養基(T25培養瓶加入約3mL，T75培養瓶加入約6mL)，隨即輕搖培養容器，使培養基和胰酶迅速混勻，終止消化。

3.3. 使用吸管或移液管吸取細胞懸液，吹打培養容器底面數次，盡可能將細胞都吹打下來。

注意：吹打動作不可劇烈，避免產生大量氣泡，否則可能損傷和損失細胞。

3.4. 將細胞懸液轉移至離心管中。用OriCell^®PBS(T25培養瓶加入約3mL，T75培養瓶加入約6mL)洗滌容器1次，收集殘留細胞。

3.5. 收集的所有細胞懸液以250×g，離心4min。

3.6. 離心后去除上清。加入2mL OriCell^®人牙髓間充質干細胞完全培養基，輕柔吹打細胞沉淀，充分吹散、混勻。將細胞按(2.5~4)×10⁴個活細胞/cm²接種至適宜的培養容器內。

注意：培養牙髓間充質干細胞對于細胞密度有較高的要求，我們建議有條件且計數效率較高的情況下，進行手工計數，以期獲得精準的細胞濃度指導接種;在沒有精確計數條件的情況下，按照適宜比例傳代是更好的方法。通常牙髓間充質干細胞傳代比例為1:3，72h內生長至可傳代匯合度。請根據細胞實際生長情況調整傳代比例。

3.7. 搖勻細胞，放入37℃、5%CO₂、飽和濕度的CO₂培養箱中。
3.8. 傳代次日，觀察細胞狀態。若發現較多漂浮細胞，應予以換液。待細胞生長至90%匯合，即需傳代或凍存。

注意：正常情況下牙髓間充質干細胞每代生長時間不超過72h，中途不需要換液，頻繁換液會破壞構建起的細胞微環境。