單克隆抗體目前被廣泛用于抗癌、抗炎和抗病毒治療。抗體的一個重要特性是細胞內化的程度、位置和速度。抗體偶聯藥物（ADC）的作用機制是向細胞內輸入細胞毒性物質引起細胞毒性殺死腫瘤細胞，其特異性和細胞的攝取程度對ADC的有效性和安全性至關重要。

因此，了解抗體在細胞內的內化，并能夠比較不同抗體的攝取情況，是生物藥物發現抗體選擇和優化的關鍵要求。

檢測和篩選抗體內化的傳統方法在應用上仍然存在一些短板：

1	采用終點式檢測，每次檢測只能獲得一個時間點的結果，無動態數據
2	檢測時因缺少環境控制而導致細胞變化
3	需多平臺聯合使用，才能準確定量
4	無法實時觀察到內化動態過程
5	無法滿足高通量篩選需求

Incucyte可提供從試劑到定量分析的一整套，抗體內化實時觀察和定量的解決方案。
 

圖1.Incucyte抗體內化實驗方案

 

 Incucyte抗體內化的主要優勢 

一步法抗體標記試劑，無需清洗和優化
 

圖2.FabFluor抗體標記試劑檢測原理
 

• Incucyte FabFluor抗體標記試劑是一個與pH敏感的熒光探針結合的Fc區域靶向Fab片段，與抗體的Fc端結合形成Fab-Ab復合物；
• 在常規培養基中（pH 7.0）,Fab-Ab沒有熒光或熒光很微弱，內化后其環境pH降低（pH4.7—6.3），Fab-Ab發出明亮的紅色熒光；
• 使用簡單快速，常溫孵育15min即可，無需清洗和優化。

實時觀察，評估抗體內化的時間依賴性變化
 
圖3.Incucyte FabFluor標記的α-CD71抗體內化到HT1080細胞的動態分析。HT1080細胞分別用FabFluor標記的α-CD71和IgG處理，用Incucyte10X鏡頭，相差成像和紅色熒光成像，拍照間隔15min，共計12h。與同型對照IgG(B)對比，α-CD71標記的實驗組（A）有明顯的紅色熒光，表明該抗體能內化到HT1080細胞內；（C）Incucyte軟件定量曲線，抗體內化隨時間逐步增加。

抗體內化的藥理學動態定量分析
 

圖4. 不同濃度的Herception內化到BT-474 Her2陽性乳腺癌細胞的動態分析及劑量反應曲線。(A)不同濃度的Herceptin-Fabfluor，其內化成濃度依賴性上升；(B)曲線下面積計算，顯示內化呈濃度依賴性上升，并得到EC50為426ng/ml。

可用于抗體的高通量篩選，提高工作效率
 

圖5. 6種抗體8個濃度梯度經Fabfluor標記后內化到HT1080細胞。AB1a,AB1b,AB2這3種抗體在低濃度時即有內化現象；AB3,AB4,AB5只在高濃度時才會發生內化現象。

Incucyte可用于96孔板多種抗體多種濃度的同時篩選，也可擴大到384孔板，大大提高工作效率。

活細胞成像系統及相關抗體內化試劑為直接研究抗體在細胞內的內化提供了一個簡單、集成和定量的解決方案，該解決方案可以很容易地同時比較多種抗體。這種方法使抗體內在化測量能夠在生物制劑發現過程的早期階段實施，并對新型治療性抗體的有效性、安全性和藥代動力學優化有價值。此外，該方法也適用于理解內吞作用、胞飲作用的基本機制。
 

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