1.      Real-time PCR數據：Real-time PCR完成后，所有數據并非可以直接導出，由于每一次實驗的情況都不相同，儀器的很多默認設定都會對最終數據結果造成重大偏差，所以在完成PCR過程后，需要人為對實驗結果進行條件設置，才能提取到科學有效的實驗結果，進而完成對實驗結果的分析和判斷。

 

2.      數據導出調整步驟：a調整參比熒光選項；b調整基線；c調整閾值

 

3.      概念：

 

a.參比熒光（dye as the passive reference）：參比熒光的作用是用來消除光程差，調整擴增曲線線形和溶解曲線峰形，與PCR反應所加熒光染料mix相關，不同公司品牌的mix所含參比熒光的種類不一樣，如：Takara選用ROX，ABI則沒有參比熒光，數據提取時，需注意下參比熒光選項，如選錯，擴增曲線或溶解曲線或將無法正確呈現。

 

b.基線（Baseline）：是指在PCR擴增反應的最初數個循環里，熒光信號變化不大。接近一條直線，這樣的直線即是基線。基線調整包括基線起點與基線重點，起點一般設在2-3個CT，終點設在擴增曲線開始上揚即進入指數增長期的CT值前2-3個CT，終點設置太靠前會降低CT值，太靠后則會增加CT值。如儀器默認基線期與上述基準不一致，很可能需要人為設定調整。

 

c.熒光域值（threshold）：一般儀器會將PCR 反應前15個循環（即基線期）的熒光信號作為熒光本底信號，熒光域值默認是PCR 3-15個循環熒光信號標準差的10倍，正確的熒光域值應設定在PCR擴增的指數期循環數。

 

4.      StepOne參比熒光: 在plate setup中選擇和設置參比熒光

5. StepOne基線（Baseline）：選中Analysis Setting按鈕，出現如下對話框

•    選中Advanced Setting選項，將每個差別大Baseline End值調到正確數值。

•    最后點擊Apply Analysis Setting按鈕

•    左圖調整前基線微上翹，有圖調整后基線平整

 

•    6. StepOne閾值（Threshold）：選中孔板中所有的數值，如下界面選擇log、Target對話框

•    將每個基因的Tredshold Auto勾選掉，閾值數值調整范圍原則在指數增長期。

閾值數值調整范圍原則在指數增長期，該范圍中，曲線斜率相同，ΔCT值不變

 

•    注意同一板結果所有內參目的基因閾值設定需一致，這樣的ΔCT有可比性。