磁珠在核酸純化中的實驗步驟解析
磁珠進行核酸純化的工作原理基于磁場分離技術和特異性吸附機制，通過磁珠與核酸分子的相互作用實現高效分離與純化。
一、磁珠結構與功能
二、核酸提取純化步驟
三、關鍵影響因素
四、技術優勢與注意事項
五、應用場景
- 核心結構
磁珠由磁性內核（如Fe₃O₄、Fe₂O₃）、中間層高分子基質（如聚苯乙烯、二氧化硅）和功能化表面基團（如羧基、羥基、Oligo(dT)）組成。- 磁性內核：提供超順磁性，使磁珠在外加磁場中快速聚集或分離。
- 功能基團：決定磁珠的吸附特異性（如羧基用于DNA吸附，Oligo(dT)用于mRNA捕獲）。
- 表面修飾技術
通過硅烷化、共價偶聯等方法修飾基團，增強核酸結合能力。例如：- 羧基磁珠：在高鹽（如NaCl）和PEG條件下，通過離子橋（DNA-鹽離子-羧基）吸附DNA。
- 硅羥基磁珠：依賴胍鹽（如GuHCl）破壞核酸水化層，通過氫鍵和范德華力結合。
- 裂解
使用裂解液（含蛋白酶K、SDS等）破壞細胞膜，釋放核酸。例如：- 動物組織需液氮研磨或蛋白酶K處理。
- 血液樣本通過紅細胞裂解液去除紅細胞。
- 結合
磁珠與核酸特異性結合：- 靜電作用：高鹽環境屏蔽核酸負電荷，促進與帶正電荷的磁珠表面結合。
- 疏水作用：PEG誘導核酸分子蜷縮，增強與磁珠的疏水相互作用。
- 氫鍵：核酸磷酸骨架與磁珠表面基團形成氫鍵。
- 洗滌
通過磁場（如達遠辰光磁力架提供的穩定磁場）分離磁珠后，用洗滌液（如75%乙醇）去除蛋白質、多糖等雜質。需注意：- 高鹽洗滌液（如TE緩沖液）用于去除污染物，低鹽洗脫液（如ddH₂O）用于釋放核酸。
- 乙醇漂洗需現配現用，避免殘留影響后續實驗。
- 洗脫
調整條件（如降低鹽濃度、升高pH）破壞核酸與磁珠的結合，回收純化核酸。例如：- 羧基磁珠在TE緩沖液中洗脫DNA。
- 硅羥基磁珠需用異丙醇或乙醇沉淀后溶解。
- 鹽濃度
- 高鹽（>0.5M NaCl）促進核酸與磁珠結合，低鹽（<0.1M）用于洗脫。
- 常用離液鹽（如GuHCl、異硫氰酸胍）增強結合效率，但需后續去除以避免PCR抑制。
- pH值
- 堿性條件（pH>8）可增強核酸與磁珠的靜電作用，但需控制時間避免降解。
- 磁珠比例與樣本體積
- 磁珠用量需根據樣本量調整（如1μg DNA對應1μl磁珠懸液）。
- 初始體積建議≥100μL，減少移液誤差。
- 優勢
- 高通量：適配96孔板自動化操作，適合大規模樣本處理。
- 特異性強：通過功能基團選擇性捕獲目標核酸。
- 快速：整個流程可在30分鐘內完成。
- 注意事項
- 避免磁珠過度干燥，否則會導致結合能力下降。
- 樣本裂解需充分，否則殘留細胞碎片會降低純度。
- 不同磁珠類型需匹配特定緩沖體系（如硅羥基磁珠禁用高濃度胍鹽）。
- 病原體檢測：快速分離病毒核酸（如新冠病毒）。
- NGS文庫構建：通過片段篩選獲得特定長度DNA。
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