近紅外激光器與SilVIR探測器助力高級多色熒光共聚焦成像

瀏覽次數：792　發布日期：2025-2-13　來源：本站　僅供參考，謝絕轉載，否則責任自負

激光掃描共聚焦顯微鏡是流行的生物研究工具。它們通常用于同時對多個熒光團進行成像，具有良好的色彩分離效果，還能通過增強的層切功能對生物標本內部進行深層成像。

如今，炙手可熱的激光技術創新可使此類應用受益，并實現高級別的實驗。在這篇文章中，我們將討論Evident的FV4000激光掃描共聚焦顯微鏡上的新型近紅外(NIR)方案如何為高級多色熒光成像提供動力。

在共聚焦顯微鏡檢查中同步采集5個以上通道
利用FV4000系統克服技術挑戰

讓我們先來了解一下多色成像實驗的歷史。多年來，許多研究人員都使用DAPI和其他兩種顏色（通常是綠色和紅色光譜）進行免疫熒光檢測。

隨著抗體和成像系統的發展，有了更多的探測器和更出色的發射波長濾色鏡，四色免疫熒光開始流行。最常見的四色組合是將DAPI、綠色、紅色和近紅外色組合在一張圖像中。

但有兩個關鍵因素阻礙了第五或第六個通道的引入：

1.缺乏光束質量好的近紅外激光二極管

首先，適合共聚焦顯微鏡的光束質量好的近紅外激光二極管并不容易獲得。足夠的功率（但不能過高）、極低的功率波動和兼容的光束輪廓都是用于共聚焦成像的激光二極管的必要特征。但直到最近，在這些波長范圍內也只有少數近紅外激光二極管可供選擇。

但由于全新激光二極管技術的出現，徹底改變了這一局面。我們的FV4000共聚焦顯微鏡現在提供685nm、730nm和785nm激光二極管，用于高效激發諸如下表所示的二級染料。

激光	熒光染料	λ_Ex (nm)	λ_Em (nm)
LD685	Alexa Fluor 680	679	702
	DyLight 680	692	712
	Alexa Fluor 700	696	719
	iRFP720	702	720
LD730	ATTO 740	743	763
	DiR	750	782
	Alexa Fluor 750	752	779
	Cy7	753	775
	DyLight 755	754	776
LD785	DyLight 800	777	794
	IR Dye 800CW	778	794
	Alexa Fluor 790	782	805
	Cy7.5	790	810

以上染料以及越來越多的新型熒光團使得增加第五和第六個同步通道進行多色成像變得更具吸引力。

2.近紅外波長靈敏度降低的光電倍增管

實現高效近紅外成像的第二個挑戰是，許多被用作激光掃描共聚焦顯微鏡標準探測器的光電倍增管(PMT)在近紅外波長區域（750nm以上）的典型檢測波長下靈敏度下降。

這種近紅外探測范圍內靈敏度降低的情況，對于在可見光譜中部具有較高靈敏度的GaAsP PMT來說尤其如此。在750nm以上范圍內，GaAsP探測器的靈敏度非常低。

為了克服這一挑戰，我們在FV4000激光共聚焦顯微鏡中采用了SilVIR探測技術。我們的SilVIR探測器利用硅光電倍增管(SiPM)，這是一種半導體傳感器，可在400nm到900nm的寬波長范圍內采集高信噪比的熒光圖像。

利用近紅外標記，實現5~6色熒光同步光譜成像

得益于這項技術，我們的FV4000系統可提供多達6個通道的SilVIR探測器，用于多色熒光應用。

與我們的X Line高性能物鏡配套使用，FLUOVEW FV4000系統可在400-1000nm范圍內提供高質量的寬色差校正。SilVIR探測器和X-Line物鏡的結合使多色熒光成像和整體近紅外成像的可靠性大大提高。

同時，近紅外成像的效率受到光路系統多方面的影響，物鏡的紅外透過率和檢測器的檢測效率毋庸置疑是核心因素，但對于激光掃描共聚焦系統，掃描單元的掃描振鏡涉及多次光路的傳輸，紅外的反射效率對圖像亮度的影響是指數級的，Evident共聚焦系統采用具有銀鍍膜的掃描振鏡，對比傳統鋁鍍膜，反射效率更高，在紅外波段的反射效率差異尤其明顯，這大大降低了紅外光信號的損失，保證了最終紅外信號的高靈敏探測。