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T7共轉錄加帽試劑盒應用與特點

瀏覽次數:993 發布日期:2024-8-26  來源:本站 僅供參考,謝絕轉載,否則責任自負

T7共轉錄加帽試劑盒應用:

體外RNA合成

T7共轉錄加帽試劑盒產品特點:

1)一步法化學加帽  一步到位,合成結束,可直接純化

2)嚴格的質量管理規范 無殘留 

3)產生的mRNA活性更高

質量控制:

純度≥95%,宿主DNA殘留≤100pg/mg,宿主蛋白殘留≤50ppm,內毒素殘留≤10EU/mg,無RNA酶、核酸內切酶、核酸外切酶、蛋白酶殘留,無菌,無病原體。
 

反應體系(僅供參考):

組分 體積(uL) 終濃度
T7 RNA Polymerase Mix 2 -
10×Transcription Buffer 2
CTP / GTP/ ATP/ UTP (100 mM each) 2 each 10 mM each
Template DNA 1 µg -
RNase free H2O Up to 20 -

注意:反應在室溫下進行,由于10×轉錄緩沖液中含有亞精胺,亞精胺濃度過高會導致DNA模板在低溫下沉淀。

備注:

1. 注意不要在反應系統中混入RNase。

2. 實驗設備(如:移液器尖端、產品管等)應嚴格使用RNase Free產品。

3.為了您的安全與健康,請穿白大褂,戴一次性手套。

4. 僅供研究使用!

常見問題解答:

1. 轉錄產量低

模板的質量與成品率密切相關。試驗組的產量顯著低于對照組,可能的原因有:①實驗模板含有抑制成分;模板有問題。

建議:①重新純化模板;②確定模板定量及其完整性;③延長反應時間;④增加模板輸入量;⑤嘗試其他啟動子和RNA聚合酶。

2. 短轉錄產量低

短轉錄起始片段會抑制該反應。當轉錄產物小于100 nt時,延長反應時間至4-8 hs或增加模板量至2 μg均可提高RNA產量。

3.RNA轉錄長度大于預期

如果電泳顯示產物條帶大于預期條帶,可能的原因是:①質粒模板可能沒有完全線性化;②感覺鏈3’端結構突出;③RNA具有未完全變性的二級結構。

建議:①檢查模板是否完全線性化,必要時進行額外線性化;②選擇合適的限制性內切酶,避免3'外翻,或使用Klenow Fragment /T4 DNA聚合酶完成轉錄后再繼續;③用變性凝膠檢測RNA產物。

4. RNA轉錄長度低于預期

如果電泳顯示產物條帶小于預期大小,可能的原因是:①模板中含有類似于T7 RNA聚合酶的終止序列;②模板中GC含量較高。

建議:①降低反應溫度(如30℃)。有時降低溫度可以增加轉錄長度,但會降低產量。或者嘗試不同的RNA聚合酶進行轉錄;②若模板GC含量較高,可采用42℃轉錄,或添加SSB以增加產量和轉錄長度。

5. 轉錄產物的電泳跟蹤

電泳過程中出現拖尾現象。可能原因:①實驗操作過程中被RNase污染;②RNase污染DNA模板。

建議:①使用不含RNase的移液針尖和EP管,佩戴一次性乳膠手套和口罩,所有試劑均使用不含RNase的H2O制備。②重新純化模板DNA。


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發布者:上海惠誠生物科技
聯系電話:18018625233
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