抗體滴度對納米流式分析細胞外囊泡結果的重要影響研究詳解

瀏覽次數：1055　發布日期：2024-7-3　來源：本站　僅供參考，謝絕轉載，否則責任自負

本研發現納米流式儀在細胞外囊泡(EV)分析時抗體滴定對實驗結果是很重要的，可以確保在EV群體中使用最佳濃度的抗體來量化其抗原標志物，并產生準確和可重復的結果。使用濃度不足的熒光抗體不能充分染色EV抗原位點，導致高于基線的熒光信號檢測不理想。相反，抗體濃度過高可導致抗體上熒光標記的潛在聚集、非特異性結合或背景信號增加。這些情況會阻礙微弱的陽性信號的檢測，使準確性受到影響。

加拿大科研人員研究發現抗體滴度對納米流式分析細胞外囊泡結果的重要影響研究。本研究使用Apogee A60 Microplus對血小板作為細胞替代品和血小板衍生顆粒作為EV群體的替代品，展示了抗體滴定過程，突出了一些關鍵的分析參數，這些參數可能會使進入EV研究領域的新研究人員感到困惑和驚訝，證明了納米流式儀和抗體滴度對實驗結果的重要影響。

所有樣品均使用Apogee A60 MicroPlus平臺進行分析，實驗結果展示了儀器的靈敏度和分辨率方面的優勢。實驗結果分別用散點圖和峰形圖來展示實驗結果，并且說明每個圖的具體樣品。(A-D)用于進一步評估平臺的成熟度，并提供可識別的尺寸參考范圍(80 nm聚苯乙/烯- 1300 nm二氧化硅)。(E-G)說明真實珠01 A，B和有機硅珠的分辨率。(H)在沒有樣品、抗體、膜染色劑和洗滌劑的情況下，顯示儀器和稀釋劑的清潔度。(I-L)血漿樣品的散點圖。(I)血漿中加入抗體CD41a-APC散點圖 (J)，血漿，抗體和添加CFDA-SE膜染料散點圖(K)，血漿，抗體散點圖(L) CFDA-SE膜染料和Triton X-100洗滌劑散點圖。

(Fig.4)

血漿是最廣泛用于疾病生物標志物評估的液體活檢之一。圖5展示了Apogee A60 Micro plus 在血漿樣本的數據。從結果可以看出CD41a陽性表位的信號強度逐漸增加，從上到下是五種不同偶聯CD41a抗體，抗體濃度從左到右增加的結果。對于每個偶聯物，在每個散點圖的右上角檢測到一個獨特的完整血小板群。隨著抗體濃度增加在基線上方明顯出現第二群CD41a陽性pdp (散點圖中心)。通常用微流式細胞術檢測許多抗體的非特異性結合，CD41a-SuperBright436滴定的上顯示了這樣一個群體(藍色圓圈)。不同的熒光偶聯抗體由高到低依次為405 nm激發(eFluor450、SuperBright436)、488 nm激發(FITC)、561 nm激發(PE)和638 nm激發(APC)（Fig.5）。

（Fig.5）

比較不同熒光偶聯物在最佳抗體濃度下對(A)陽性染色血小板和(B) pdp的檢測。不同偶聯抗體的完整血小板檢測濃度相似，但pdp檢測濃度隨著熒光團相對亮度的增加而明顯增加。當使用最佳抗體濃度時，無論選擇何種偶聯物，檢測到的完整血小板的濃度都是相似的。相比之下，pdp的檢測濃度隨著偶聯抗體亮度的增加而顯著增加。每個歐聯抗體的相對亮度提供了將離散的陽性信號移動到“噪音”或陰性背景閾值之上的能力，并被計算為一個“事件”。隨著EV尺寸的減小，潛在可用抗原的比例減少，因此信號的相對強度也相應降低。因此，當粒子群變小時，粒子本身或探測表面抗原的信號強度最終會合并到負的粒子群中。這也意味著更亮的偶聯物可以使更大比例的小粒子越過檢測閾值。此外，歐聯物的大小可以給粒子增加顯著的粒徑測量值，從而增加粒子穿越儀器的光散射檢測閾值的能力。

結論：由于各種技術原因，用于分析EV表面抗原的抗體滴定具有挑戰性。必須非常小心地確保儀器和試劑在合理范圍利用。完整分析MFI、濃度、分離或染色指數數據是非常有益的，而簡單地將相同的細胞分析程序轉換為EV分析可能會導致重大問題。使用標準化的方案來定義實驗的最佳抗體濃度將會提高數據質量。

英國Apogee超靈敏納米流式分析儀，專為外泌體微囊泡（EVs）等小顆粒分析優化設計，在EVs樣品顆粒大小分析，絕對定量，多標記物同時快速分析工作中廣泛應用。截止目前，該設備已累計參與數百篇高質量同行審議文章相關實驗分析工作。其出色的靈敏度，穩定性及可靠性已備受業內廣泛認可，并將繼續為EVs相關基礎研究及轉化應用提供堅實支持。

Apogee納米流式除了可用于納米級別的顆粒（如：細胞外囊泡、外泌體、微生物、病毒顆粒、LNP）等，還可以用于作常規動物細胞檢測（如免疫細胞、哺乳類動物細胞、等）。它是一臺全面且功能強大的納米流式分析儀！