YAP（Yes相關蛋白）是一種轉錄共激活蛋白。它通過從細胞質轉位到細胞核而激活，從而調節基因表達并促進腫瘤發生。在細胞核內，YAP與TEAD、MAML1/2等伴侶蛋白的結合可促進YAP的細胞核滯留，進而刺激細胞增殖、存活和遷移，并驅動耐藥性。

然而，與果蠅同源物Yorkie不同，目前尚未在哺乳動物YAP蛋白中發現經典的核定位信號（NLS）。那么，這就帶來了一個有趣的問題，哺乳動物細胞中的YAP是如何入核的？

近日，海軍軍醫大學第二附屬醫院謝渭芬、張新團隊和中國科學院上海藥物研究所羅成團隊合作，在《Signal Transduction and Targeted Therapy》雜志（IF=39）上發表論文，回答了這個問題。

這項研究首次證明了SOX9是驅動YAP核轉位的關鍵調節因子，并提出了通過靶向SOX9-YAP相互作用來治療YAP驅動癌癥的潛在策略。
 

圖片來源：《Signal Transduction and Targeted Therapy》
（https://doi.org/10.1038/s41392-024-01805-4）

研究材料與方法
在這項研究中，研究人員從肝細胞癌（HCC）細胞著手開展研究。他們委托賽業生物構建了敲除SOX9的Huh-7細胞和HEK-293細胞，并利用過表達SOX9和YAP的慢病毒載體來評估蛋白功能。他們利用免疫共沉淀、體外pull-down分析、鄰位連接分析（PLA）和微量熱涌動（MST）分析等來探究蛋白之間的相互作用。

技術路線
01 利用SOX9基因敲除和過表達來研究SOX9對YAP活性的影響
02 分析SOX9與YAP之間的相互作用，驗證SOX9促進YAP核轉位的假設
03 通過蛋白突變分析探索SOX9與YAP相互作用的分子基礎
04 開發競爭性多肽來破壞SOX9-YAP相互作用，并評估該多肽對腫瘤生長的影響

研究結果
1 SOX9通過直接相互作用促進YAP的核轉位
作為一種轉錄因子，SOX9在多個生物過程中發揮關鍵作用。YAP和SOX9在許多腫瘤中被異常上調，成為推動腫瘤進展的關鍵調節因子。最近的研究發現，SOX9可能是YAP活性的正調節因子，具體取決于細胞微環境和腫瘤異質性。不過，SOX9是否會影響YAP的核轉位，目前仍有待探索。

為了評估SOX9是否會影響YAP的激活，研究人員委托賽業生物構建了SOX9基因敲除（SOX9^KO）的Huh-7細胞。RNA測序數據顯示，在SOX9^KO細胞中，YAP相關通路和YAP靶基因受到全面抑制。利用表達YAP的慢病毒感染Huh-7細胞后，他們觀察到SOX9的缺失明顯抑制了Huh-7細胞的增殖、遷移和侵襲。SOX9表達的升高顯著增強了YAP靶基因的轉錄。這些結果確定了SOX9是肝細胞癌進展過程中YAP功能的強效調節因子。

研究人員接著檢測了SOX9和YAP在肝細胞癌組織中的表達情況，以探索SOX9調節YAP功能的潛在機制。他們發現，YAP的細胞核水平與SOX9呈正相關（圖1）。敲除SOX9會抑制Huh-7和HEK-293細胞中YAP的核轉位，并降低YAP-TEAD的轉錄活性（其中HEK-293細胞也由賽業生物提供）；相反，過表達SOX9則會顯著增強細胞中的YAP活性并提高YAP的細胞核水平。

他們還觀察到，SOX9和YAP的共表達可促進YAP的核轉位，若SOX9未表達，則幾乎觀察不到YAP的核轉位。這些數據表明，YAP的核轉位需要SOX9。免疫共沉淀和體外pull-down分析證明，SOX9和YAP之間存在直接的相互作用。鄰位連接分析（PLA）的結果也證實，細胞在感染了表達SOX9的慢病毒后，內源YAP和外源SOX9的聚集逐漸從細胞質轉移至細胞核（圖1）。這些結果支持了SOX9與YAP的直接相互作用促進YAP核轉位的假設。
 

圖1 SOX9通過與YAP直接相互作用來促進YAP的核轉位^[1]

2 SOX9與YAP相互作用的分子基礎
接下來，研究人員探究了SOX9與YAP相互作用的分子基礎。他們發現，含有HMG結構域（aa 94-210）的SOX9片段參與了YAP與SOX9的相互作用。進一步的分析表明，SOX9的HMG結構域中的N端NLS（aa 94-126）與YAP之間存在高親和力相互作用（圖2）。

之后，通過一系列分析，他們發現D125A突變降低了SOX9誘導的YAP在Huh-7細胞中的核轉位和活性，也明顯降低了SOX9對YAP誘導的轉錄激活和HCC細胞增殖的影響。這些結果表明D125殘基是SOX9-YAP相互作用所必需的，也證實SOX9充當了YAP的細胞核“穿梭巴士”。
 

圖2 SOX9的Asp-125殘基是SOX9誘導YAP核轉位所必需的^[1]

分子對接分析表明，SOX9的D125殘基同時與YAP的R124和S127相互作用。研究人員發現，R124K突變而非S127A突變顯著削弱了YAP與SOX9的相互作用。此外，R124K突變也顯著阻礙了YAP入核，并降低了YAP-TEAD的轉錄激活。與這些結果相一致的是，R124K突變也減少了YAP誘導的惡性增殖以及YAP在Huh-7細胞中的致癌作用。

他們之后使用了過表達YAP或YAP^R124K的肝細胞特異性YAP基因敲除（Yap^HKO）小鼠，采用二乙基亞硝胺加四氯化碳法誘導小鼠患上肝細胞癌。所有Yap^HKO+hYAP小鼠（5/5）都形成了肉眼可見的腫瘤，而五只Yap^HKO+R124K小鼠中只有兩只出現了小的腫瘤結節。這些數據表明，YAP的R124是YAP與SOX9相互作用的關鍵氨基酸，因此會影響YAP的致癌活性。

此外，研究人員還在HCC細胞和HCC標本中檢測到YAP在R124位點的不對稱二甲基化（YAP-R124me2a）。他們發現，精氨酸甲基轉移酶PRMT1與YAP直接結合，催化了YAP-R124的不對稱二甲基化。微量熱涌動（MST）分析顯示，YAP多肽（aa 115-135）與SOX9-HMG結構域的結合親和力在R124me2a修飾后增加，但在R124K突變后消失，表明YAP-R124的不對稱二甲基化增強了YAP與SOX9的相互作用。

越來越多的研究表明，YAP的激活對許多癌癥的進展至關重要，但YAP的mRNA表達水平和蛋白水平與癌癥患者的總生存期并無明顯相關性。研究人員發現，與周圍的非癌變組織相比，HCC組織中YAP-R124me2a的水平顯著升高。重要的是，高水平的YAP-R124me2a與HCC患者的不良預后顯著相關。這些結果表明，YAP-R124me2a有望作為多種腺癌的生物標志物和治療靶點。

3 競爭性多肽可破壞SOX9與YAP的相互作用
基于以上這些結果，研究人員設計出一種多肽Pep-S-A1，包含參與SOX9-YAP相互作用的關鍵殘基D125。分析表明，Pep-S-A1以劑量依賴的方式破壞了HCC細胞中YAP與SOX9的相互作用。用Pep-S-A1處理Huh-7細胞可降低YAP的細胞核水平并抑制YAP靶基因的表達。在體外和體內實驗中，Pep-S-A1都能夠抑制腫瘤生長。這些數據表明，破壞YAP與SOX9的相互作用可能是一種很有前景的腫瘤治療策略（圖3）。
 

圖3 SOX9通過直接相互作用觸發YAP入核的機制示意圖^[1]

研究結論
總的來說，這項研究揭示了SOX9一種之前從未發現的功能，作為關鍵癌基因的“擺渡”調節因子。同時，研究也闡明了YAP入核的分子機制。研究還表明，PRMT1催化的YAP-R124me2a可促進YAP核轉位，并作為預測癌癥患者生存結果的通用標志物。更重要的是，研究人員還發現SOX9-YAP復合物的解離是治療YAP驅動癌癥的潛在方法。

參考文獻：
[1]Qian, H., Ding, CH., Liu, F. et al. SRY-Box transcription factor 9 triggers YAP nuclear entry via direct interaction in tumors. Sig Transduct Target Ther 9, 96 (2024). https://doi.org/10.1038/s41392-024-01805-4