spheroONE球狀組織分選在自動化和高度可重復的3D細胞培養中的應用
CELLENION* UPM
將GrowDex®和spheroONE結合以實現自動化和高度可重復的3D細胞培養工作流程
摘要
本應用說明展示了spheroONE和GrowDex®的兼容性,用于自動化3D細胞培養工作流程。
spheroONE是一款納升級細胞分選儀,可以分選和分離球形細胞和器官組織。GrowDex® 是一種植物提取的納米纖維素 (NFC) 水凝膠,為培養各種類型的細胞提供有效的3D基質。在這項工作中,研究人員證明,在這種納米纖維素基質中播種的單個 HepG2 細胞可以無縫地培育出大量 HepG2 球形樣本。隨后,spheroONE可用于自動分配GrowDex®到微孔板中,以便對單個HepG2球體進行分選、分離和嵌入,為后續的篩選應用準備高度可重復的檢測就緒微孔板。
介紹
近年來，人們對3D模型的興趣激增，這是因為它們與傳統的2D模型相比更具有生理學的相關性。這些3D模型表現出獨特的特征，如空間結構、擴散阻隔、獨特的基因表達模式和耐藥性。它們已成為再生醫學研究和抗腫瘤藥物篩選的首選。我們的研究提供了一個專門針對HepG2球體的解決方案。該模型應用廣泛，包括肝病建模（非酒精性脂肪肝、肝癌、病毒性肝炎）、肝毒性評估以及了解藥物在生理環境下對肝細胞的影響。HepG2 球形細胞還有助于肝臟代謝、酶活性和基因表達分析，揭示各種肝臟相關疾病的復雜分子機制。確保使用3D模型進行可重復的高通量篩選取決于基于大小和形態選擇高度均勻的球體群體。這種均勻性是可靠和可重復實驗的基礎，需要適當的培養基質來保證球形體的持續生長和活力，從而實現長期篩選。為此，我們推出了一種將先進的spheroONE技術與GrowDex®的優質特性相結合的解決方案。
SpheroONE是一種創新型儀器，專為分離和分選球形體、腫瘤細胞和器官組織等大顆粒而設計。它的自動化功能簡化了工作流程并提高了效率。此外，它還能精確分配緩沖液和培養基，是一種適用于多種應用的多功能工具。
另一方面，GrowDex® 水凝膠是不含動物成分的植物提取納米纖維素 (NFC) 水凝膠，可為培養各種類型的細胞提供有效的3D基質。GrowDex 類似于人體的細胞外基質，支持細胞生長，并使分子易于擴散。GrowDex® 與自動化兼容，不需要特殊的處理和儲存條件，易于操作，因此非常適合各種基于3D細胞的篩選應用。先進的SpheroONE技術與成熟的GrowDex®之間的共生協同效應在3D細胞培養和篩選領域樹立了新的標準，為研究人員提供了一個強大而多功能工具，以促進他們的研究并加速科學發現。
方法與結果
A. 在GrowDex® 中形成HepG2球形細胞：
HepG2細胞在完整培養基中傳統單層培養4天。通過將GrowDex®原液（1.5% w/v）與完整培養基稀釋，制備GrowDex® 工作溶液（0.5% w/v）。收獲 HepG2 細胞,并以 10^5 cells/mL 的濃度將其重新懸浮在GrowDex® 工作溶液
（0.5%w/v）中。將懸浮在GrowDex®中的細胞移液至96孔底平底ULA板的每個孔中（100 µL/孔）,結果每孔約有 10,000 個細胞。隨后，用移液管將完全培養基移入每個孔（100 µL/孔）,置于細胞負載的 GrowDex® 層之上（圖 1）。最后,將微孔板置于標準細胞培養條件下（37°C,5%CO2）培養 5 天，得到 HepG2 球形細胞。
圖1. 在GrowDex®中高通量形成HepG2球體的過程。
a. HepG2 細胞的2D培養。 b. 收獲細胞并將其重新懸浮在用培養基稀釋的 GrowDex® 中。c. 將 100µL HepG2 細胞培養在 GrowDex® 中的每個孔中并加入100µL細胞培養基。d. 培養 5 天后在 GrowDex® 中形成 HepG2 球形細胞。
培養5天后,每孔產生約1400個HepG2 小球。顯微鏡成像顯示了直徑約為50至130微米的異質球體群。
B.使用spheroONE進行GrowDex®配液：spheroONE能夠自動分配各種溶液和試劑（粘度高達22.5 mPa*s，如70%甘油溶液）。spheroONE 由一個加壓儲液器、一個電磁閥和一個小孔徑噴嘴組成,可實現高精度的納升級按需滴加。通過控制滴液體積和點滴次數,它為微孔板的每個孔提供了一種通用解決方案,可重復地填充納升至微升級別的溶液體積。
在這項研究中,SpheroONE 成功地將 GrowDex® 0.5% w/v 自動分配到 384 ULA 板（15 µL/孔）中。使用 600 µm納米噴點毛細管（NDC 600）噴點水凝膠,閥門參數如下:壓力為 mBar，啟動時間為 1500 ms。使用SpheroONE進行自動孔預填充大大方便了微孔板制備，并顯著減少了氣泡的形成，而氣泡的形成通常會阻礙手動移液的微孔板制備。
C.使用spheroONE分離HepG2球形顆粒：
借助spheroONE的光學系統（包括高分辨率攝像頭、暗場照明模塊）和玻璃 NDC，它能夠檢測、分析、排序和分離直徑在50至600范圍內的顆粒。當顆粒沉降減少時，使用spheroONE進行顆粒的分離和回收效果大大提高。在這項研究中，將球狀體在GrowDex®中重新懸浮，顯著減輕了顆粒的沉降，從而大大提高了回收和分離效率。
在球形體分離當天,將GrowDex® 中的100µL 球形體培養物（在 A 部分中制備）重懸于2mLPBS 中,以獲得GrowDex® 0.025%w/v中約700個球狀體/mL的最終濃度。隨后將該樣品放入spheroONE的儲液器中,并與預填充的384 ULA 板（在 B 部分中制備）一起安裝在spheroONE內。
spheroONE安裝了NDC 300（直徑 300 μm），并設置了以下閥門參數:壓力為200mBar,啟動時間為 10 ms。檢測和分離參數設置如下表1所示。
圖2. 使用spheroONE 對HepG2 球體進行排序和隔離。
a. 暗視野圖像展示一個球體（直徑99 微米,長徑比：1.68）。b. 顯微鏡圖像展示在384 ULA 板孔內分離的一個球體。c. 散點圖表示實驗期間檢測到的球體,綠色表示分離的球體,黃色表示由于NDC 中存在多個顆粒而未分離的球體，粉色表示不符合分離標準的球體。
在 384 ULA 板的每個孔中,單個 HepG2 球形體被成功分離到預填充的 GrowDex® 層上（圖 2）。然后使用spheroONE進行另外兩個試劑分配步驟：每個孔中再加入 15 µl 0.5% w/v 的 GrowDex® 以完全包埋球形體；最后，在包埋的 HepG2 球形體上分配 25µl 完全培養基,以獲得可用于進一步培養和/或篩選的平板。
研究結論
這項研究成功證明了 GrowDex® 和 spheroONE 在3D細胞培養實驗微孔板制備自動化和標準化方面的協同作用。第一步展示了使用 GrowDex® 在單個 96 孔 ULA 板中高通量形成 10 萬多個 HepG2 球形細胞的優勢。在第二步中，SpheroONE 被用作試劑分配器，在 384 孔 ULA 板的每個孔中預先填充一層 GrowDex®。隨后，用SpheroONE裝入HepG2球形體, 然后在384孔ULA板內對單個球體進行排序和分離。最后,用 spheroONE 再分裝一層 GrowDex®，將每個小球完全包埋，并在頂部加入培養基（圖3）,以獲得可用于進一步實驗或篩選應用的微孔板。
這一工作流程的主要優勢在于其簡化的自動化操作，通過使用spheroONE既能將規定體積的 GrowDex®（和試劑）精確分配到預定義的目標平板中，又能高精度地排序和分離單個球體。
這種創新方法展示了在 GrowDex® 中高效率和高通量準備球體的成本效益，然后在準備好的實驗板中自動準備具有單個球體的統一孔位，這將對高度可重復的3D細胞培養實驗產生重要影響。
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