急性胰腺炎（Acute pancreatitis, AP）作為臨床常見急腹癥，病死率高達20-40%。近年來，隨著飲食組成的改變，我國高甘油三酯血癥性胰腺炎（Hypertriglyceridemic pancreatitis, HTGP）發病率呈逐年升高趨勢，以“年輕化、重癥化、易復發、并發癥多”為主要臨床特點，己超過酒精性胰腺炎成為AP的第二大類型，給臨床救治工作帶來極大困難。多項研究均已證實，HTGP伴有較高的病死率，易并發多臟器衰竭、感染性胰腺壞死等并發癥，住院時間更長，再入院率更高。探究HTGP的發病機制將有利于延緩該病進展，以期為HTGP患者提供精準化、個體化的治療策略。目前，有關HTGP發病機制研究多聚焦于脂質代謝、局部微循環、炎癥反應及遺傳性因素等方向。雖然相關研究逐年增加，但確切機制仍未完全闡明。

腸道菌群作為機體的重要組分，參與調控代謝產物合成、宿主防御及免疫調節等多種重要的生物學過程，對維持機體穩態與平衡有重要價值，有望成為胰腺疾病治療的新靶點。然而，腸道菌群是否調節HTGP進展缺乏充足的實驗證據，及其具體分子機制尚不清晰。

2023年10月4日，哈爾濱醫科大學孫備團隊在《Nature Communications》發表題為“Gut microbiota aggravates neutrophil extracellular traps-induced pancreatic injury in hypertriglyceridemic pancreatitis”的研究論文。該研究發現高甘油三酯血癥性胰腺炎（HTGP）患者腸道單形擬桿菌（B.uniformis）豐度下調，導致其代謝產物牛磺酸遷移至胰腺內減少，進而激活中性粒細胞內NF-κB、IL-17信號通路及促進結腸IL-17釋放加速胰腺中性粒細胞胞外捕獲網形成（NETs），最終加劇HTGP胰腺損傷。本研究為腸道菌群恢復免疫動態平衡，緩解HTGP胰腺損傷提供有力證據。
 

圖片來源：《Nature Communications》
（https://doi.org/10.1038/s41467-023-41950-y）

研究材料
在這項研究中，研究人員使用了Gpihbp1敲除小鼠（由賽業生物提供，產品編號：S-KO-12718）構建了HTGP模型，以及使用了Pad4敲除小鼠（由賽業生物提供，產品編號：S-KO-03607）構建了NETs缺陷模型。

研究方法
采用了多種實驗技術，包括各種組織學染色、WB、qPCR、轉錄組學測序（RNA-seq）、非靶向代謝組學、氨基酸靶向代謝組學、單細胞轉錄組測序、流式細胞術、免疫熒光、ELISA等。

技術路線
01 檢測高甘油三酯血癥性胰腺炎患者的腸道菌群變化情況
02 移植HTGP患者糞便顯著加重疾病嚴重程度，并發現特異性菌群改變（Bacteroides uniformis）與HTGP進展密切相關
03 腸道菌群衍生的牛磺酸可遷移至胰腺直接抑制NF-κB、IL-17信號通路激活減少胰腺NETs形成
04 腸道菌群可抑制結腸Th17激活并減少IL-17通過“腸-胰軸”向胰腺釋放，緩解胰腺NETs形成

研究結果

HTGP患者中腸道菌群變化[1]

為研究HTGP患者特異性菌群差異，研究人員比較三組人群樣本腸道菌群間的菌群豐度差異。相較于健康人群（HC）組，HTGP患者腸道菌群的α多樣性顯著降低（圖1a），β多樣性顯示 HTGP、HTG及HC人群的腸道菌群組成與結構具有顯著差異（圖1b）。基于屬、種水平分析，研究團隊發現HTGP患者的腸球菌及大腸埃希菌等條件性致病菌豐度顯著上調，而 Faecalibacterium prausnitzii，Faecalibacterium，Bacteroides uniformis 等有益菌豐度豐度顯著下調（LDA>4, P<0.05）（圖1d-f）。其中腸道菌群與HTGP病情嚴重程度具有相關性，如：Bacteroides uniformis及Bacteroides vulgatus與系統性并發癥發生呈負相關（圖1g），上述結果揭示了腸道菌群標志物在HTGP診治中的臨床價值。
 

腸道菌群紊加重HTGP進展[1]

為明確是否腸道菌群變化直接導致HTGP進展，研究人員利用FMT構建菌群人源化小鼠模型，并對FMT后各組小鼠進行病理學相關檢測。結果顯示：相較于移植健康人群組，移植HTGP患者糞便（FMT-HTGP）組小鼠的胰腺損傷程度、炎癥指標（淀粉酶、脂肪酶、TNF-α、IL-1β）水平均顯著升高（圖2a-c）。16S檢測發現FMT-HTGP組腸道菌群的α多樣性顯著降低（圖2d），β多樣性顯示三組腸道菌群組成與結構具有顯著差異（圖2e）。基于種水平分析， Bacteroides uniformis同樣在FMT-HTGP組中顯著下調（P<0.05）（圖2f-g）。
 

腸道菌群通過調控胰腺NETs形成緩解HTGP進展[1]

為證明腸道菌群對HTGP胰腺組織免疫細胞的調控，流式細胞術發現FMT-HTGP組小鼠胰腺中性粒細胞的募集與活化顯著增強，CD45+Ly6g+細胞比例升高（圖3a）。進一步利用免疫組化比較胰腺組織中性粒細胞的表達與分布，結果提示：Ly6g在FMT-HTGP組中表達顯著上調（圖3b）。轉錄組測序顯示差異mRNA表達數據進行功能預測分析，提示FMT-HTGP組胰腺中的白細胞活化、中性粒細胞浸潤及中性粒細胞脫顆粒等功能富集顯著上調（圖3b, d）。單細胞數據經過t-SNE降維聚類、差異表達基因分析，研究人員通過細胞注釋獲得13類細胞（圖3e），同樣印證了中性粒細胞在FMT-HTGP組中占比明顯升高（圖3f）。Cxcl2、Il23a、Ccl6、Ccl21等介導中性粒細胞趨化的基因在FMT-HTGP組上調，并發現介導NETs形成的關鍵基因Padi4、Cd177、MPO等在FMT-HTGP組中同樣顯著上調（圖3g）。GSEA分析提示，相較于FMT-HC組，FMT-HTGP組中性粒細胞的NETs通路富集評分及其激活的關鍵基因更高（圖3h, i）。提取兩組小鼠外周血中性粒細胞，細胞染色SYTOX觀察NETs形成差異，顯示FMT-HTGP組NETs形成明顯增強（圖3j），胰腺組織內同樣證實FMT-HTGP中NETs激活明顯增強（圖3k-l）。
 

Bacteroidesuniformis通過抑制NETs形成來緩解HTGP[1]

B.uniformis在HTGP患者和FMT-HTGP組明顯降低（圖4a-b）。為探究B.uniformis是否通過中性粒細胞發揮作用，研究者進行B.uniformis灌胃而后構建HTGP模型。結果發現：B.uniformis緩解HTGP胰腺損傷（圖4c），減輕HTGP炎癥反應。B.uniformis干預可緩解HTGP病程中胰腺中性粒細胞的過度募集及胰腺NETs形成（圖4d, e）。

此外，研究人員對抗生素處理后的Gpihbp1^-/-敲除鼠（賽業生物提供）構建HTGP模型進行B.uniformis干預（圖4b），結果提示：相較于對照組小鼠，單菌干預組（B.U+HTGP）組小鼠的胰腺損傷程度、炎癥指標等均顯著降低（圖42f, g）。進一步分析發現，在Gpihbp1^-/-敲除鼠中，B.uniformis同樣有效抑制了中性粒細胞的募集與NETs的形成。CD45與Ly6g、CitH3與MPO免疫熒光雙染證實，B.U+HTGP組胰腺組織中性粒細胞的募集與NETs形成顯著減少（圖4h-k）。綜上，研究者發現B.uniformis可通過抑制中性粒細胞浸潤及NETs形成，進而緩解HTGP。
 

Bacteroidesuniformis衍生牛磺酸可緩解HTGP[1]

在FMT試驗中，研究人員分別對FMT-HC組與FMT-HTGP組血漿樣本進行非靶向代謝組學測定，結果提示：糞便牛磺酸在FMT-HC組中表達水平升高（圖5a），ELISA證實代謝組學結果（圖5b），菌群-代謝相關性分析提示：B.uniformis可能通過促牛磺酸合成延緩HTGP進展（圖5c）。在單菌試驗中氨基酸靶向代謝組學測定，結果提示：糞便牛磺酸在B.U+HTGP組中表達水平升高（圖5d），ELISA檢測B.U+HTGP小鼠血漿牛磺酸水平同樣高于對照組（圖5e）。基于多組學研究結果，研究人員發現牛磺酸是腸道菌群緩解HTGP進展的關鍵代謝產物，隨即驗證牛磺酸在HTGP中的緩解作用（圖5f）。相較于對照組（HTGP），給予HTGP小鼠牛磺酸飲用水干預周后，牛磺酸干預組（Tau+HTGP）小鼠胰腺損傷明顯緩解（圖5g），中性粒細胞比例表達下調（圖5h），NETs形成顯著減少（圖5i, j）。

此外，研究人員對Gpihbp1^-/-敲除鼠同樣進行驗證，證實牛磺酸干預組（B.U+HTGP）組小鼠的胰腺損傷程度顯著降低（圖5k）,中性粒細胞比例表達下調（圖5l），NETs形成顯著減少（圖5m, n）。綜上，研究者發現牛磺酸是B.uniformis干預后的關鍵菌群代謝產物，其可能通過腸屏障進入至血循環及胰腺組織中，依賴于中性粒細胞及NETs發揮抗炎作用。
 

牛磺酸通過抑制NETs形成緩解HTGP[1]

PAD4是NETs形成的關鍵基因，Pad4基因敲除小鼠（Pad4^-/-）是公認的NETs缺陷模型。為驗證牛磺酸與HTGP病程中NETs形成的直接相關性，研究者利用Pad4敲除小鼠（賽業生物提供）構建HTGP模型，并分別予以牛磺酸或無菌水分別干預，共分為HTGP、Pad4^-/-+HTGP、Tau+Pad4^-/-+HTGP三組（圖6a）。首先，研究人員發現抑制NETs形成可明顯緩解HTGP進展，而對于Pad4^-/-小鼠構建的HTGP模型，牛磺酸干預并未起到明顯的緩解作用（圖6b-e）。此外，免疫熒光分析提示，Pad4^-/-+HTGP組小鼠胰腺組織及外周血中性粒細胞的活化和NETs形成顯著減輕，而對牛磺酸干預對此小鼠無明顯緩解作用（圖6f）。同樣，研究人員提取各組小鼠外周血中性粒細胞并觀察體外NETs形成印證上述結論（圖6j-i）。綜上，研究人員進一步利用了Pad4敲除鼠構建HTGP-NETs缺陷模型，從動物水平證實牛磺酸對于HTGP病程中NETs形成的直接抑制作用。
 

明確B.uniformis及牛磺酸在HTGP患者中的作用[1]

基于上述研究，研究人員發現B.uniformis促牛磺酸合成抑制NETs形成在HTGP中的重要作用。為進一步明確上述菌群、代謝、免疫節點在HTGP診治中的重要臨床價值，研究者收集20名健康志愿者及30名HTGP患者臨床血液樣本并進行相關性分析（圖7a）。血清ELISA證實健康人群的NETs水平顯著低于HTGP患者，同時NETs水平與HTGP嚴重程度成正相關；健康人群的牛磺酸水平顯著高于HTGP患者，與NETs水平呈顯著負相關（圖7b-c），B.uniformis豐度與血清牛磺酸水平呈正相關（圖7b, d）。

進一步研究發現，健康人群外周血中性粒細胞無明顯NETs表現，而HTGP患者外周血可見明顯NETs形成，提取HTGP患者外周血提取的PMN進行牛磺酸干預，發現HTGP+Tau組體外NETs形成明顯減少（圖7e）。此外，研究者提取小鼠外周血中性粒細胞，PMA體外誘導NETs形成，同時加入HC人群與HTGP患者血漿上清進行體外共培養，結果發現：相較于PMA誘導NETs形成組，健康人血清干預組NETs緩解，而HTGP患者血清干預組NETs并未緩解（圖7f）。相較于PMA體外誘導NETs組，牛磺酸處理可導致中性粒細胞內磷酸化NF-κB蛋白水平顯著降低（P<0.05），同時NF-κB和IL-17A的mRNA水平降低（圖7g-i）。綜上，研究人員從臨床樣本中證實了B.uniformis、牛磺酸、NETs形成的相關性，并進一步驗證了健康人血清對NETs形成的緩解作用及牛磺酸抑制NETs形成的確切機制，發掘了B.uniformis及牛磺酸在HTGP治療中的臨床價值。

研究結論
該研究發現高甘油三酯血癥性胰腺炎（HTGP）患者腸道單形擬桿菌（B.uniformis）豐度下調，導致其代謝產物牛磺酸水平降低，進而通過激活NF-κB、IL-17信號通路及促進結腸IL-17釋放加速胰腺中性粒細胞胞外捕獲網形成（NETs），最終加劇HTGP胰腺損傷。

原文檢索：
[1]Li, G., Liu, L., Lu, T. et al. Gut microbiota aggravates neutrophil extracellular traps-induced pancreatic injury in hypertriglyceridemic pancreatitis. Nat Commun 14, 6179 (2023).
 

賽業小鼠模型構建

賽業生物構建了Gpihbp1及Padi4（Pad4）基因敲除小鼠與條件性基因敲除小鼠，更有活體小鼠已加入『紅鼠資源庫』，快至2周交付！確保您在短時間內獲得更具性價比的實驗用鼠，為您的研究加點速~
 

Gpihbp1 KO小鼠

品系名稱：
C57BL/6JCya-Gpihbp1^em1/Cya
品系編號：
KOCMP-68453-Gpihbp1-B6J-VA
產品編號：
S-KO-12718
應用方向：
代謝,內分泌,心血管,血液,肝臟,遺傳,罕見病
 

Gpihbp1 flox小鼠

品系名稱：
C57BL/6JCya-Gpihbp1^em1flox/Cya
品系編號：
CKOCMP-68453-Gpihbp1-B6J-VA
產品編號：
S-CKO-14174
應用方向：
代謝,內分泌,心血管,血液,肝臟,遺傳,罕見病

Padi4 KO小鼠

品系名稱：
C57BL/6NCya-Padi4^em1/Cya
品系編號：
KOCMP-18602-Padi4-B6N-VA
產品編號：
S-KO-03607
應用方向：
癌癥,神經元,免疫,眼科,血液,肝臟,遺傳,罕見病
 

Padi4 flox小鼠

品系名稱：
C57BL/6NCya-Padi4^em1flox/Cya
品系編號：
CKOCMP-18602-Padi4-B6N-VA
產品編號：
S-CKO-04225
應用方向：
癌癥,神經元,免疫,眼科,血液,肝臟,遺傳,罕見病