乳腺腫瘤細胞從原發(fā)性部位的親本細胞擴散為異質性細胞群，如轉移性腫瘤。異質性進展是一個復雜的動態(tài)過程，涵蓋了腫瘤進展和轉移的整個臨床史，由腫瘤細胞和旁觀者細胞（bystander cell）之間的相互作用所驅動。腫瘤微環(huán)境的各種固有細胞（resident cell）類型都與此有關。例如：造血譜系的細胞在此過程中起著驅動作用；骨髓造血干細胞生態(tài)位是異質性腫瘤細胞存活和定植的適宜空間。另一種重要的旁觀者細胞類型，即間充質干細胞/基質細胞（MSCs），可能被吸引到腫瘤微環(huán)境中成為腫瘤相關的成纖維細胞，通過影響腫瘤細胞存活、治療耐藥性、血管生成和免疫逃逸來促進異質性進展。最重要的是，骨髓源性間充質干細胞（BM-MSCs）通過促進異質性腫瘤細胞定植和增殖來調節(jié)骨轉移。由于腫瘤異質性進展和轉移涉及與多種旁觀者固有細胞類型的相互作用，因此需要合適的實驗模型來剖析乳腺癌進展和轉移的機制。

目前的研究使用各種共培養(yǎng)模型來研究腫瘤和間充質基質細胞之間的相互作用。研究發(fā)現(xiàn)，在共培養(yǎng)過程中，腫瘤細胞與旁觀者細胞融合可能導致腫瘤細胞異質性。這些結果表明，腫瘤微環(huán)境中的旁觀者細胞在異質性進展中起著決定性作用，并且與BM-MSCs的相互作用是腫瘤細胞獲得骨轉移潛力的直接途徑。

在美國西達賽奈醫(yī)療中心（Cedars-Sinai Medical Center）團隊的一項研究中，課題人員研究了另一個浸潤腫瘤微環(huán)境的重要旁觀者細胞群——造血細胞（HCs），是否可以與腫瘤細胞相互作用以促進異質性進展。實驗用紅色熒光蛋白（RFP）標記的人乳腺癌 MCF-7 細胞首先與 HCs共培養(yǎng)，然后與 BM-MSCs 共培養(yǎng)，通過腫瘤細胞中穩(wěn)定的形態(tài)學、行為和蛋白質表達變化證實了旁觀者細胞在腫瘤異質性進展中的作用。具體研究內容發(fā)表在 CELLS 期刊題為“Breast Cancer MCF-7 Cells Acquire Heterogeneity during Successive Co-Culture with Hematopoietic and Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem/Stromal Cells”。

造血譜系的細胞是腫瘤微環(huán)境中旁觀者細胞的重要組成部分，因為各種類型的 HCs都是腫瘤浸潤細胞并顯示出轉移趨向性。研究人員通過進行一系列的共培養(yǎng)實驗，選擇了具有代表性的紅色熒光蛋白（RFP）標記的克隆RMCF7-2用于后續(xù)研究。

首先，通過將不同類型（健康供體和乳腺癌患者的PBMCs）的 HCs 與RMCF7-2 細胞單層進行共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)與不同HCs共培養(yǎng)均可導致RMCF7-2 細胞的形態(tài)和行為變化。例如，在與乳腺癌患者的PBMCs共培養(yǎng)中，單層中的單個RMCF7-2細胞在第一周內會收縮，彼此失去接觸，同時出現(xiàn)懸浮的大而圓的紅色熒光細胞。第二周，附著的RMCF7-2細胞數(shù)量減少，大部分細胞脫離，采用懸浮生長（圖1）。這說明，上皮細胞RMCF7-2與HCs共培養(yǎng)后采取懸浮生長的模式。

細胞間接觸的喪失似乎是一種先天或程序性的反應，因為在RMCF7-2細胞與所有11種人類和6種小鼠HCs 共培養(yǎng)中也觀察到相同的反應。這一系列的共培養(yǎng)物表明，無論使用哪種類型的HCs，RMCF7-2細胞都會以相似的形態(tài)和行為變化做出反應。由此可見，直接接觸存活的HCs能夠誘導RMCF7-2細胞改變形態(tài)和生長行為。

圖1 RMCF7-2 與 HCs 共培養(yǎng)過程中的形態(tài)和生長行為。

為了評估觀察到的變化是短暫的還是永久性的，使用 G418（300 μg/mL）處理共培養(yǎng)物清除剩余的 HCs，留下懸浮的紅色熒光細胞繼續(xù)培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)來自共培養(yǎng)物的紅色熒光細胞在第 15 次傳代后仍保持增殖，表明獲得性懸浮生長是一種穩(wěn)定的表型。然后建立了用于詳細分析的克隆細胞（MAF-2 和MAF-12）（圖2），進行持續(xù)的傳代以進一步評估克隆細胞在懸浮生長中的穩(wěn)定性。盡管這些懸浮的衍生克隆的生長速度通常比親本RMCF7-2細胞慢，但都沒有失去懸浮生長的跡象。因此，HC樣形態(tài)和懸浮液生長的獲得特征是相當穩(wěn)定的。

接下來，為了描述伴隨形態(tài)和行為轉換的基因表達變化，實驗通過MCF-7細胞標記蛋白來檢測分離的衍生克隆細胞，蛋白質印跡法鑒定實質性的表達變化。結果觀察到，第30次傳代的 MAF-2和 MAF-12克隆表達顯著降低的 ERα。另一個突出的變化是PR表達的丟失。相比之下，盡管EGFR1水平升高，但ERβ或Her2/neu水平幾乎沒有變化。有趣的是，當這些細胞放棄上皮形態(tài)時，大量的E-cad持續(xù)存在，盡管水平較低，而在這些細胞中未檢測到波形蛋白。從第30代到第60次傳代，表達變化持續(xù)存在。這些結果表明，穩(wěn)定的表型轉換伴隨著基因表達的穩(wěn)定變化。

圖2 將RMCF7-2與乳腺癌患者PBMCs 共培養(yǎng)分離的MAF-2和MAF-12克隆以1:5的重復比例進行連續(xù)培養(yǎng)。在傳代60次時拍攝細胞圖像。

乳腺癌經常轉移到骨骼。在此過程中，轉移細胞可能會與不同的旁觀者細胞（包括BM-MSCs）發(fā)生連續(xù)相互作用。因此，實驗將克隆的 MAF-2 與 MAF-12 細胞和 hBM-MSCs 進行了另一輪共培養(yǎng)，并監(jiān)測共培養(yǎng)中的細胞形態(tài)和生長行為。

第二輪共培養(yǎng)的觀察結果顯示，懸浮生長中的MAF-2和MAF-12細胞在基質單層存在下恢復了附著生長。腫瘤細胞和hBM-MSCs之間經常發(fā)生細胞融合事件（圖3A），表現(xiàn)為紅色熒光細胞，但具有hBM-MSCs形態(tài)。在第三周，紅色熒光細胞開始成群出現(xiàn)，很可能是因為克隆擴增（圖3 B）。這些細胞呈短紡錘形，沒有細胞間接觸，分散排列或重疊生長，而一些附著生長的細胞仍然保持圓形細胞形狀（圖3 A、B）。在4 周的共培養(yǎng)結束時，hBM-MSCs 單層細胞充滿了異質性腫瘤細胞簇，代表具有不同克隆形態(tài)和生長行為的單個紅色熒光克隆。這些結果再次證明，與旁觀者細胞的相互作用改變了腫瘤細胞的形態(tài)和生長行為。由于腫瘤-間充質干細胞相互作用發(fā)生在單個細胞之間，因此這種相互作用可能會單獨影響癌細胞，從而導致克隆間異質性。

圖3 與 hBM-MSCs 進行第二輪共培養(yǎng)，使 MAF-2 和 MAF-12 細胞的附著生長行為發(fā)生改變。

為了分離與 hBM-MSCs 共培養(yǎng) 4 周后恢復附著生長的紅色熒光癌細胞，加入 G418 以清除基質細胞，然后進行克隆，報告顯示了MAF-2與hBM-MSCs共培養(yǎng)的5個克隆細胞（MAF-BMSC-1—5）的形態(tài)。不同的形態(tài)和恢復的附著生長行為是穩(wěn)定的。然后進行了另一輪蛋白質印跡分析以評估標記蛋白表達的狀態(tài)。盡管重新采用了附著生長，但所有五個 MAF-BMSC 克隆都更接近親本 MAF-2 細胞的表達模式，顯示 ERα 表達降低、PR 表達丟失和 EGFR1 水平升高。但E-cad水平仍然很低，波形蛋白仍然檢測不到。因此，從第二輪共培養(yǎng)中分離的克隆與親本 MAF-2 和祖代 RMCF7-2 細胞都具有離散的異質性。

最后，實驗評估了連續(xù)共培養(yǎng)是否會導致與親代細胞行為異質性的癌細胞變化。與RMCF7-2細胞相比，從連續(xù)共培養(yǎng)（MAF-BMSC-1、-3和-5）中選擇的克隆細胞均顯示出更快的細胞增殖（圖4 A）、更高的遷移能力（圖4 B）和較大的異種移植腫瘤形成（圖4 C），盡管行為變化在克隆細胞之間的程度不同。有趣的是，MAF-2 和 MAF-12 的增殖和遷移都很緩慢（圖4 A、B），而使用相同接種方案的重復動物研究表明 MAF-2 和 MAF-12 細胞不能形成異種移植腫瘤（圖4 C）。因此，未來需要進一步檢查以確定RMCF7-2和HC共培養(yǎng)的其他克隆細胞是否也失去了異種移植腫瘤形成的潛力。

圖4 與旁觀者細胞共培養(yǎng)誘導行為異質性。將選定的MAF-BMCS克隆（-1、-3和-5）與親本MAF克隆（-2和-12）和祖本RMCF7-2克隆的行為變化進行比較。

總之，該研究使用連續(xù)共培養(yǎng)來模擬骨腫瘤微環(huán)境中癌細胞與浸潤的HCs和固有BM-MSCs的相互作用，表明在連續(xù)共培養(yǎng)下，與旁觀者細胞的相互作用會引起永久性的形態(tài)學、生長行為和基因表達變化，這是研究乳腺癌進展和轉移過程中腫瘤細胞異質性的有力模型。與這項研究相關的是，需要對其他 MAF 克隆進行額外的行為分析，以確定 RMCF7-2 和 HCs 之間的共培養(yǎng)是否使懸浮液中的所有癌細胞在相同參數(shù)下侵襲性降低，還需要分析其他基因表達變化，以揭示第二輪共培養(yǎng)后新獲得的侵襲性的其他伴隨表達變化。腫瘤細胞異質性證實了乳腺癌進展和轉移的過程，腫瘤細胞異質性處于動態(tài)狀態(tài)，最有可能由腫瘤細胞和旁觀者細胞之間的持續(xù)相互作用來維持。闡明腫瘤細胞異質性進展的機制是腫瘤轉移研究的目標。

參考文獻：Wang R, Wang X, Yin L, Yin L, Chu GC, Hu P, Ou Y, Zhang Y, Lewis MS, Pandol SJ. Breast Cancer MCF-7 Cells Acquire Heterogeneity during Successive Co-Culture with Hematopoietic and Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem/Stromal Cells. Cells. 2022 Nov 10;11(22):3553. doi: 10.3390/cells11223553. PMID: 36428982; PMCID: PMC9688235.
原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/36428982/

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