cGAS-STING信號通路是天然免疫系統的重要組成部分。cGAS作為異常胞漿DNA的重要傳感器，在病原體入侵和細胞應激時被活化并進一步激活下游銜接蛋白STING（干擾素基因刺激因子），進而啟動先天免疫反應。cGAS通過誘導干擾素刺激基因（ISG）的表達，在抗病毒反應和抗腫瘤免疫中發揮關鍵作用。相反，cGAS-STING通路的異常激活已被證明是自身免疫性和自身炎癥性疾病的關鍵發病機制。TREX1是負責降解胞質DNA的核酸外切酶，其功能缺失突變導致胞質dsDNA的積累和cGAS-STING途徑的異常激活，隨后引發自身免疫性疾病如Aicardi-Goutières綜合征（AGS）或凍瘡性紅斑狼瘡和系統性紅斑狼瘡（SLE）。此外，各種細胞損傷引起的線粒體DNA應激也通過觸發cGAS活性促進炎癥反應。cGAS在先天免疫和自身炎癥反應中的重要作用支持cGAS作為cGAS活性異常相關疾病的潛在藥物靶點。

近年來，人們致力于開發強效和特異性cGAS抑制劑，靶向cGAS活性位點的多種化學支架的cGAS抑制劑已通過高通量篩選試驗發現，并通過藥物化學進行了優化。與傳統的蛋白質配體結合口袋不同，蛋白質-DNA界面的溶劑暴露、高正電荷和平坦的特性使開發具有類藥物性質的小分子抑制劑充滿挑戰性。大環肽已被證明是調節蛋白質-蛋白質相互作用（PPIs，開發小分子抑制劑的具有挑戰性的界面）的有效工具，因為它們具有高效力和選擇性，因此大環肽成為調節蛋白質-DNA界面的潛在骨架。
 

圖片來源：《Nature Communications》
（https://www.nature.com/articles/s41467-023-41892-5）

2023年10月2日，北京大學全軍民教授團隊聯合中山大學卜憲章教授團隊在Nature Communications在線發表了題為“Development of cyclopeptide inhibitors of cGAS targeting protein-DNA interaction and phase separation”的研究論文，這項研究通過靶向PPIs（蛋白質-蛋白質相互作用）環肽庫的體外篩選，鑒定出一類新型cGAS環肽抑制劑。聯合團隊通過分子模擬、體外生化實驗以及細胞實驗驗證了該抑制劑靶向cGAS和dsDNA之間的蛋白質-DNA界面，破壞dsDNA和cGAS之間的相互作用，進一步抑制dsDNA誘導的cGAS液液相分離（LLPS）。同時，優化的類似物XQ2B在體外和體內抑制了單純皰疹病毒-1（HSV-1）誘導的抗病毒免疫反應，并增強了HSV-1感染。此外，XQ2B顯著抑制Trex1^-/-小鼠原代巨噬細胞中I型干擾素和促炎細胞因子水平的升高以及Trex1^-/-小鼠的全身炎癥。這項工作為突破現有cGAS抑制劑臨床應用的局限性提供了新的思路，也為自身免疫及自身炎癥性疾病的治療提供新的策略。

研究材料
在這項研究中，研究人員利用Trex1敲除小鼠構建自身免疫性疾病模型（由賽業生物提供，產品編號：S-KO-05559）。體外研究則采用了THP1細胞以及人原代PBMCs細胞和相關鼠源細胞，并提取了Trex1敲除小鼠的骨髓來源的巨噬細胞。

研究方法
作者采用了多種實驗技術，包括各種組織學染色、WB、qPCR、熒光偏振、微量熱泳動、表面等離子共振、流式細胞術、免疫熒光、ELISA等。

技術路線
01 從體外大環肽庫中篩選cGAS抑制劑
02 通過人源和鼠源細胞中驗證了環肽化合物的cGAS抑制效力和特異性
03 體外驗證了環肽化合物與cGAS結合作用機制
04 體外驗證了環肽化合物抑制DNA誘導的cGAS液相縮合
05 體外和體內水平驗證了環肽化合物減弱宿主的抗病毒防御
06 在自身免疫疾病模型小鼠——Trex1^-/-小鼠（由賽業生物提供）中，驗證了環肽化合物減輕了小鼠的全身炎癥

研究結果

XQ2與cGAS結合并阻斷cGAS-DNA相互作用[1]

為了從大環肽庫中篩選靶向蛋白質-DNA界面的cGAS抑制劑，作者應用了一種基于RNA的熒光生物傳感器來檢測2',3'-cGAMP，用于體外篩選cGAS活性抑制劑，并通過細胞實驗進一步篩選驗證。在體外蛋白水平和細胞水平測定中苗頭分子（hits）之間的抑制活性差異可能歸因于它們不同的細胞滲透性，作者鑒定出XQ2在細胞測定中具有最佳cGAS抑制活性，并進一步驗證了XQ2特異性抑制人源和鼠源細胞中dsDNA誘導的cGAS活化和cGAS-STING信號傳導。

接下來，作者在體外通過表面等離子體共振（SPR）、微量熱泳動（MST）以及熒光偏振（FP）等技術分析表明XQ2與cGAS直接結合，并阻斷cGAS與DNA的相互作用。值得關注的是研究發現胞內高濃度的ATP/GTP顯著促進XQ2與cGAS的結合親和力（K_d=4.5±1.6 μM vs K_d=45.3±26.9 μM），該作用模式與目前報道的cGAS抑制劑活性因胞內ATP/GTP競爭而減弱顯然不同。作者進一步結合分子對接及定點突變闡明XQ2與cGAS的潛在結合模式。
 

XQ2抑制DNA誘導的cGAS液液相分離[1]

DNA誘導的cGAS液液相分離（LLPS）在調節酶活性和先天免疫信號傳導中起著至關重要的作用。鑒于XQ2對dsDNA與cGAS結合的抑制作用，作者進一步在體外蛋白水平和細胞水平驗證了XQ2以劑量依賴的方式有效抑制DNA誘導的cGAS液液相分離。
 

XQ2B抑制Trex1^-/-小鼠的全身炎癥[1]

為了評估XQ2B的臨床應用價值，作者利用自身免疫性疾病模型——Trex1^-/-小鼠（由賽業生物提供），進一步驗證了XQ2B顯著抑制了Trex1^-/-小鼠原代巨噬細胞中I型干擾素和促炎細胞因子的表達水平以及Trex1^-/-小鼠的全身炎癥，表明XQ2B有效地減輕了Trex1^-/-小鼠的全身炎癥，突出了靶向蛋白質-DNA界面的cGAS特異性抑制劑在cGAS相關自身免疫性疾病中的治療潛力。

研究結論
總之，這項研究通過體外生化實驗、分子模擬、細胞實驗和動物實驗等技術手段，成功鑒定出一類全新作用機制的cGAS環肽類抑制劑，靶向蛋白質-DNA界面，并阻斷DNA誘導的cGAS液相縮合和活化。一種優化的類似物XQ2B在體外和體內抑制HSV-1誘導的抗病毒免疫反應，并顯著抑制Trex1^-/-小鼠原代巨噬細胞中I型干擾素和促炎細胞因子水平以及Trex1^-/-小鼠的全身炎癥。XQ2B作為首例靶向蛋白-DNA界面及液液相分離的特異性cGAS抑制劑，為進一步開發cGAS相關自身免疫性和自身炎癥性疾病藥物提供新的思路。

原文檢索：
[1]Wang X, Wang Y, Cao A, Luo Q, Chen D, Zhao W, Xu J, Li Q, Bu X, Quan J. Development of cyclopeptide inhibitors of cGAS targeting protein-DNA interaction and phase separation. Nat Commun. 2023 Oct 2;14(1): 6132.
 

賽業小鼠模型構建

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Trex1 KO小鼠

品系名稱：
C57BL/6JCya-Trex1^em1/Cya
品系編號：
KOCMP-22040-Trex1-B6J-VA
產品編號：
S-KO-05559
應用方向：
神經系統,骨骼,心血管,血液,生理系統,遺傳,腎臟
打靶方案：

Trex1 flox小鼠

品系名稱：
C57BL/6JCya-Trex1^em1flox/Cya
品系編號：
CKOCMP-22040-Trex1-B6J-VA
產品編號：
S-CKO-17795
應用方向：
神經系統,骨骼,心血管,血液,生理系統,遺傳,腎臟
打靶方案：