01背景介紹 
TMT全稱為串聯質譜標簽（tandem mass tag），是基于質譜MS2實現定量的同位素標簽^[1]。TMT標記試劑分子包括三個部分：用作MS2/MS3定量的報告離子、與肽段N端或者側鏈的賴氨酸結合的胺基反應基團、連接報告離子和氨基反應基團的質量平衡基團。質量平衡基團保證每個TMT分子的總分子量一致，而經碎裂產生的報告離子分子量各有不同。因此，可以根據各自的標簽實現不同樣品中相同多肽的定量比較。在母離子碎裂過程中，報告離子同時斷裂，相應多肽的豐度便可以報告離子比值來表示。TMT定量方法目前最高可達18標，可用于多條件比較，且定量穩定性好，在蛋白質組學定量中得到廣泛應用。PEAKS Online支持TMT MS2/MS3定量分析及結果可視化。

02案例研究目的
儀器和數據采集方法的改進極大地促進了多通路標記的蛋白質組學定量深度。本數據案例^[2]中，作者在Thermo Eclipse上使用三種不同的數據采集方法對相同的樣本分別分析，以展示real-time search (RTS)采集方法的優勢。

圖1 定量分組

03實驗設計
分別提取11種人類細胞系(RKO, A549, U87 MG, HCT116, HEK293T, HeLa, MCF7, U2OS, SUM159, PANC1, and Jurkat)的全蛋白提取、還原烷基化、Trypsin/LysC酶切，酶解肽段用TMT11plex試劑盒完成標記后等量混合，然后通過高pH反向HPLC分為96個餾分，最終合并為24個，然后選擇互不相鄰的12個樣本在Eclipse上完成上機。數據采集使用了三種模式：MS2，SPS MS3，RTS-SPS-MS3。

圖2 文獻實驗設計

04數據分析
我們下載了原文獻中的36個質譜原始數據（MS2，SPS MS3，RTS-SPS-MS3各12個,SPS MS3只選擇90min梯度數據），在PEAKS Online中進行分析，定量方法選擇軟件內置的TMT11pelx（CID/HCD）,樣本間的校正選擇Auto normalization（Fig 3）。

圖3 校正方法

05三種采集方法的鑒定結果對比
從表1和圖4可以看出，MS2方法從定性定量到的蛋白、肽段數量上看，均優于MS3的方法，但是據先前報道所述，MS2的定量準確性比MS3低 ^[3]。因此我們進行了不同采集方法間不同細胞系之間的定量比值。

圖4 三種采集方法定性定量結果對比

06不同細胞系之間蛋白定量的差異分析
蛋白定量結果展示如圖5。我們又深入對比了Human RelA-associated inhibitor（iASPP）在三種采集方法下，不同細胞系之間的TMT定量結果。為了消除偏差，選擇該蛋白下的相同肽段用作比較。

圖5 蛋白/肽段定量視圖

Human RelA-associated inhibitor(iASPP)是一種參與細胞凋亡和轉錄的調節因子，通過抑制B細胞活化因子 NF-kappa-B和特異性蛋白1 (SP1)，阻斷HIV-1病毒的轉錄。在11個人類細胞系中，SUM159的iASPP豐度最高。然而，三種采集方法在SUM159中獲得的iASPP豐度比值存在顯著差異(圖6)：在RTS-SPS-MS3和SPS-MS3中分別為23.39和18.75，而在MS2采集方法中，該比值僅為7.52。在其他細胞系中也發現了類似的趨勢。一定程度上表明，TMT MS3能更準確地揭示標記通道之間的比值。

圖6 iASPP在不同細胞系中的定量比值。RKO設置為reference，理論比值為1.

07結論
PEAKS Online能完成各種復雜實驗設計的TMT標記定量分析。

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08參考文獻
1.Thompson, A. et al. Tandem mass tags: a novel quantification strategy for comparative analysis of complex protein mixtures by MS/MS. Analytical Chemistry 75, 1895–1904 (2003)

2.Yu, Q. et al. Benchmarking the orbitrap tribrid eclipse for next generation Multiplexed Proteomics. Analytical Chemistry 92, 6478–6485 (2020).
3.Ting, L., Rad, R., Gygi, S. et al. MS3 eliminates ratio distortion in isobaric multiplexed quantitative proteomics. Nat Methods 8, 937–940 (2011).

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