冠狀動脈旁路移植術（CABG）是冠心病心肌缺血的有效治療手段之一，自體大隱靜脈（SVG）移植仍是現今CABG中最常用的旁路血管。然而，越來越多的證據表明，由于靜脈橋平滑肌細胞（SMCs）的異常增殖、遷移，導致血管不良重塑、新生內膜進行性增厚和再狹窄，嚴重影響了靜脈橋的長期通暢率和靜脈移植的失敗。

據報道，生長因子和機械應力可以將靜脈SMCs的表型從靜止的收縮表型轉變為高度增殖和合成的表型。研究表明，靜脈移入動脈循環后，靜脈SMCs會立即暴露于血管壁隨動脈血壓周期節律性變形引起的動脈周期性張應變下。盡管相關研究表明動脈機械拉伸在新內膜增生和靜脈移植失敗中起重要作用，但其分子機制仍遠未完全了解。

Lamtor1（也稱為p18）是一種特異定位于晚期內小體/溶酶體表面的膜蛋白，在溶酶體表面上激活雷帕霉素復合物1的哺乳動物靶標（mTORC1），并在隨后調節細胞生長和穩態中發揮關鍵作用。mTOR信號被機械拉伸和初級纖毛激活，初級纖毛是一種重要的機械傳感器。然而，mTORC1對機械刺激的反應機制尚不清楚，Lamtor1 是否具有機械反應性，調節 mTOR 信號的激活，以及它們在靜脈移植后內膜增生中靜脈 SMCs 的去分化和增殖中的機械生物學作用也未知。

在上海交通大學生命科學技術學院力學生物學研究所、上海交通大學醫學院附屬新華醫院小兒外科、上海交通大學附屬第六人民醫院內分泌代謝科團隊的一項研究中，采用體內“cuff”技術的靜脈移植動物模型和體外應變加載系統，研究了動脈周期性張應變對Lamtor1表達和靜脈SMC分化的影響。全轉錄組測序數據結合生物信息學分析提示circSlc8a1可能作為miR-20a-5p的海綿靶向Lamtor1。基于SMC特異性Lamtor1敲除（KO）小鼠，還進一步研究了Lamtor1和相關非編碼RNA（ncRNAs）是否可以提供新的潛在治療靶點，以防止內膜形成和靜脈移植失敗。具體內容發表在 Theranostics期刊題為“Arterial cyclic stretch regulates Lamtor1 and promotes neointimal hyperplasia via circSlc8a1/miR-20a-5p axis in vein grafts”。
 

首先，利用“cuff”技術構建小鼠靜脈移植模型，模擬臨床搭橋手術，并檢測小鼠移植靜脈中的新生內膜，發現移植1周后新生內膜明顯增厚，增生面積明顯增加。

為了確定Lamtor1在內膜形成中的作用，檢查了靜脈移植后Lamtor1的表達，發現移植靜脈中的Lamtor1顯著增加，且在新生內膜區表達急劇增加。增加的 Lamtor1 主要與 α-SMA 共定位，表明其在靜脈 SMCs 中的細胞質表達。有趣的是，mTORC1的表達也上調。

之前揭示了內膜增生中靜脈SMCs的異常增殖，在這里，通過Western blot分析了靜脈SMCs的表型轉化，這是增殖的基本步驟。結果表明，靜脈移植物中α-SMA、鈣調蛋白和SM22的表達均受到抑制。

這些數據表明，靜脈移植到動脈循環后，Lamtor1 表達增加，并伴有 mTORC1 激活，以及靜脈 SMCs 的去分化和增殖。這些過程可能參與靜脈移植后的新內膜增生。

接下來，為了進一步了解靜脈移植中 Lamtor1 調控的機制，對移植靜脈和自體靜脈對照進行了 RNA-seq。結果顯示，有86個差異表達的miRNAs預測了與Lamtor1的結合位點，其中52個miRNAs在移植靜脈中與自體對照組相比下調（圖1 A）。

根據TargetScan數據庫，miR-17-92簇和miR-29簇被預測參與Lamtor1的調控（圖1 B），這兩個miRNA簇與Lamtor1 3'-UTR結合的預測種子區域如圖所示圖1 B。然后進一步驗證miR-17-92簇和miR-29簇的差異表達，結果表明，除miR-20b-5p外，移植靜脈中miR-17-92簇和miR-29簇均被顯著抑制（圖1 C）。

RNA-seq還顯示，移植靜脈中有8個circRNAs上調，4個circRNAs下調（圖1 D）。經過驗證這些候選circRNAs的表達，circSlc8a1是移植靜脈中上調最顯著的（圖1 E），并且是人、小鼠和大鼠中唯一保守的circRNA（圖1 F）。因此，接下來的研究集中在circSlc8a1上。

FISH結果顯示，陽性circSlc8a1染色和SMA陽性細胞均主要在體內新生內膜中表達（圖1 G）。在培養的靜脈SMCs中，circSlc8a1與細胞質中的α-SMA共定位（圖1 H），這也表明了miR海綿的潛在作用。

圖1 CircSlc8a1 作為 miR-17-92 的海綿，促進了 Lamtor1 的表達。

然后通過特異性敲低circSlc8a1的表達研究其在靜脈SMCs增殖和去分化中的作用。結果顯示，敲低circSlc8a1可降低靜脈SMCs的增殖，靜脈SMC分化標志物α-SMA、鈣調蛋白和SM22的表達顯著升高，且circSlc8a1 的下調也抑制了 Lamtor1 的表達。

進一步確定與circSlc8a1結合的潛在miRNAs，發現circSlc8a1和miR-20a-5p在Ago2沉淀的復合物中顯著富集。Western blot分析表明，circSlc8a1敲低抑制Lamtor1表達并促進靜脈SMC分化，而同時轉染miR-20a-5p可逆轉這些作用。此外，miR-20a-5p沉默消除了circSlc8a1對Lamtor1蛋白表達的抑制作用。circSlca81特異性siRNA抑制SMCs增殖，而miR-20a-5p抑制消除了circSlc8a阻斷的抑制作用。

此外，實驗還確定了 Lamtor1 的效應子 mTORC1 是否有助于靜脈 SMC 去分化。雷帕霉素（mTORC1特異性抑制劑，可誘導靜脈SMC分化）和Lamtor 1特異性siRNA增加了收縮標志物的表達，包括α-SMA、鈣調蛋白和SM22，并抑制了增殖。為了驗證 Lamtor1 或 cirSlc8a1 是否通過 mTORC1 參與 SMC 去分化，用亮氨酸激活 mTORC1，結果顯示，在mTORC1激活過程中，α-SMA、鈣調蛋白和SM1等收縮標志物的表達降低，而同時敲低Lamtor1或circSlc8a1的表達可增加α-SMA、鈣調蛋白和SM22的表達。

這些結果驗證了circSlc8a1和miR-20a-5p在靜脈SMCs中的直接相互作用，表明circSlc8a1作為miR-20a-5p海綿，正向調控靜脈SMCs中Lamtor1的表達。

進一步地，實驗研究了體外機械周期性應變（10%，1.25 Hz，6h，10h，24h）是否調節了靜脈SMCs中circSlc8a1/miR-20a-5p/Lamtor1的表達（圖2 A）。

與靜態對照相比，10% 周期性張應變顯著提高了circSlc8a1的表達（圖2 B），但在6h并持續到24h時降低了miR-20a-5p表達（圖2 C）。進一步檢測Lamtor1的表達和mTORC1信號的活性，發現周期性張應變在6h和12h點顯著上調Lamtor1表達（圖2 D），并刺激mTORC1、4EBP1和p70S6K的磷酸化（圖2E）。

然后檢測 Lamtor1 是否參與了周期性張應變對靜脈 SMC 的去分化和增殖，發現與靜態對照相比，應變誘導的BrdU摻入量為1.7倍（圖2 F），并降低靜脈SMC收縮標志物的表達（圖2 G）。而Lamtor1 siRNA逆轉了機械應變對靜脈SMC增殖的影響（圖2 F）和去分化（圖2 G、H）。

此外，還檢測了應變是否通過circSlc1a8調節Lamtor1的表達并促進靜脈增殖和去分化。通過敲低circSlc8a1，可以逆轉機械應變誘導的增殖增加（圖2 I）和收縮標記物表達的減少（圖2 J）。同時，circSlc8a1敲低逆轉了機械應變誘導的靜脈SMC中Lamtor1表達的增加（圖2 J）。

這些結果表明，動脈機械張應變誘導circSlc8a1和隨后的Lamtor1的表達，參與靜脈SMCs的去分化和增殖，并可能參與了靜脈移植過程中的血管重塑。

圖2 動脈機械拉伸上調 circSlc8a1 和 Lamtor1。

最后，實驗試圖確定circSlc8a1在體內新生內膜形成中的潛在作用，發現CircSlc8a1敲低可顯著減弱移植靜脈中新生內膜的形成。Western blot和免疫染色結果顯示，circSlc1a8敲低組移植靜脈中Lamtor1蛋白水平降低，mTORC1和底物（包括p70S6K和4EBP1）的磷酸化也顯著減弱，并促進靜脈SMC的分化。

然后接著評估了 Lamtor1 在移植靜脈新生內膜形成中的作用。通過生成 SMC 特異性 Lamtor1 KO 小鼠，發現小鼠靜脈介質層中Lamtor1的表達被消除（圖3 A、C），在1周靜脈移植物中顯示出內膜面積和內膜與中膜比率的顯著降低（圖3 B）。然后研究了 SMCs 中 Lamtor1 的特異性缺失是否抑制了體內 mTORC1 的活性。免疫染色顯示，小鼠中移植靜脈的p70S6K磷酸化顯著降低（圖3 D），收縮蛋白的表達升高（圖3 E）。

這些數據表明，體內 SMCs 中 Lamtor1 的特異性 KO 減弱了 mTORC1 信號的激活和靜脈 SMC 的去分化，這也有助于搭橋手術后新生內膜的形成。

圖3 SMC 中 Lamtor1 的消除減弱了靜脈移植手術誘導的新內膜形成。

圖4 圖形概要

總之，該研究表明，Lamtor1 通過激活 mTORC1 信號通路并誘導靜脈 SMCs 的去分化和增殖來誘導靜脈移植后新生內膜增生。CircSlc8a1 響應動脈周期性張應變，充當 miR-20a-5p 的海綿，隨后調節 Lamtor1 的表達。敲低 Lamtor1 或 circSlc8a1 可減輕靜脈移植中的內膜增生。因此，包括circSlc8a1和Lamtor1在內的這些機械反應分子可能為人自體靜脈移植手術后的內膜增生提供潛在的治療靶點。盡管基于高度的同源性和保守性，體內和體外動物模型研究為CABG術后內膜形成的診斷和治療提供了重要建議，但circSlc8a1/miR-20a-5p軸的臨床實驗在進一步的研究中仍然至關重要。

參考文獻：Liu JT, Yao QP, Chen Y, Lv F, Liu Z, Bao H, Han Y, Zhang ML, Jiang ZL, Qi YX. Arterial cyclic stretch regulates Lamtor1 and promotes neointimal hyperplasia via circSlc8a1/miR-20a-5p axis in vein grafts. Theranostics. 2022 Jun 21;12(11):4851-4865. doi: 10.7150/thno.69551. PMID: 35836818; PMCID: PMC9274756.
原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/35836818/

小編旨在分享、學習、交流生物科學等領域的研究進展。如有侵權或引文不當請聯系小編修正。如有任何的想法以及建議，歡迎聯系小編。感謝各位的瀏覽以及關注！
微信搜索公眾號“Naturethink”，了解更多細胞體外仿生培養技術及應用。

點擊了解
細胞流體剪切力|共培養|壓力培養|牽張應變|血管培養|平行平板流動腔|儀器|上海泉眾機電科技有限公司Naturethink
http://www.Naturethink.com/

Naturethink牽張力|拉伸力|細胞拉伸|細胞牽張|細胞牽張應變|牽張應變細胞培養儀
http://www.Naturethink.com/?product/19.html