Knock-in

對于Knock-in，目前還存在一定的難度，大多數的出版物只能實現10-40%的敲入效率，不同位點也存在差異。Nature Biotechnology今年5月的一篇出版物利用獨有的SLEEK (SeLection by Essential-gene Exon Knock-in)技術可以在T細胞上實現超過90%的KI效率，同樣在其他常用的免疫細胞如NK，B cell，IPSC等細胞都實現了非常高的KI效率。

對于常規的KI實驗，我們依然可以從以下方面考量進行進一步優化：

Donor DNA用量的測試

▲ Theodore L Roth et al., 2018
 

▲ Zelda Odé et al., 2020

HA長度

HA的長度會影響KI的效率，但并不意味著越長越好。

▲ Zelda Odé et al., 2020
 

▲ Soyoung A. Oh et al., 2022

HA修飾

▲ Brian R. Shy et al., 2021
 

▲ Jonas Kath et al., 2022

特殊成分提高HDR效率的測試

也有文獻結果表明PGA對KI的效率沒有幫助，僅供參考。

▲ Ya-Wen Fu et al., 2021
 

▲ David N. Nguyen et al., 2020

選擇dsDNA或ssDNA或AAV載體進行KI

dsDNA會隨著用量的增加顯著增加對細胞活率的影響。

▲ Theodore L Roth et al., 2018

HDR Enhancer

▲ Jonas Kath et al., 2022

甚至HDR, RNP, 細胞的混勻順序也可能會對結果造成影響

▲ Theodore L Roth et al., 2018

電轉前后培養體系

▲ Theodore L Roth et al., 2018

Nucleofection 條件優化

通常可以參考KO的條件進行KI實驗，但依然可以依照具體的實驗需求調整。

▲ Theodore L Roth et al., 2018

▲ Soyoung A. Oh et al., 2022

對于Knock-in，還可以通過其他手段提升結果，如PAM and Track mutations, 具體內容可以參考如Cas蛋白或sgRNA供應商。

通常KO不會對細胞的活率產生太大影響，但是對于KI，需要用到donor DNA，如dsDNA，或者使用更強的電轉染條件，這些可能會導致活率的負面影響。