01.透化組織或細胞與分離的線粒體（pti、pce與imt）

1.1. 一般注意事項

1. 呼吸量通常與分離線粒體（imt）中的線粒體蛋白量或透化組織（pti；包括滲透肌纖維pfe）中的組織量有關，而在活細胞和滲透細胞中，每個細胞的O2流量通常是歸一化的。需要注意，對每個線粒體蛋白的呼吸通量變化的解釋是不同的，每質量的組織是組織特異性，而不是線粒體特異性通量，每百萬細胞呼吸通量隨細胞大小變化，因此不能比較如血小板和成纖維細胞或心肌細胞。

2. 使用人體骨骼肌滲透性纖維（pfe）對進行的呼吸檢測結果與imt的數據一致。

3. 將電子傳遞到呼吸系統的不同復合物、三羧酸循環的不同片段和轉運體的特定底物，用于特定線粒體通路的功能評估。

4. 評估氧化磷酸化的最大能力需要底物組合，以重建生理三羧酸循環功能。

5. 很少有關于pfe的研究報道氧通量對不同底物濃度的依賴性，且pfe或pce和imt的直接比較也很少。

6. 因為敏感性不同，pce和pti的最佳解偶聯劑濃度不能從imt的研究中推斷出來。

1.2. 透化組織或細胞的優勢 (pti、pce)

1. 與imt相比，pti需要更少的組織或更少的細胞。使用O2k，每次實驗測試僅需1 mg 濕重的心臟纖維，或30萬個細胞（成纖維細胞、內皮細胞），在37°C的2 ml艙室中。

2. 與優化pti相比，imt的優化可能會花費更多時間。

3. 所有類型的線粒體都可以在pti和pce中通過實驗獲得，即imt制備允許分離不同的線粒體。

1.3.分離線粒體 (imt) 的優勢

1. imt的制備需要分離和研究不同的線粒體亞群。

2. imt的混懸液代表組織樣本的平均值。

3.由于O2擴散到非灌注纖維束中的線粒體，滲透肌纖維呼吸的氧依賴性增加了兩個數量級。因此，我們選擇imt來進行線粒體氧動力學的研究（小的懸浮細胞也是一個很好的模型）。在對肌肉纖維的研究中，必須嚴格避免低氧水平。電解產生的O2和H2O2滴定到含有H2O2的MiR06中，增加了O2k艙室內的O2濃度。

4. ADP必須在高濃度下加入到pfi中，以達到最大的氧化磷酸化容量，因為擴散限制和線粒體外膜可能發揮不同于imt的屏障功能。

 

02.透化組織制備和呼吸測量

 

1. 機械組織分離的評價：機械組織分離必須使用適當鋒利的鑷子，其分離程度可以通過觀察分離的纖維束的顏色的變化來評價（類似于肝組織），將培養皿放在深色背景上時，可更好的觀察到這一點。常規實驗的一個實際限制可能是10-20 mg濕重的組織，隨后被分成2-5 mg的樣本進行實驗。

2. 細胞膜的機械和化學透性：機械組織制備導致細胞膜的部分（骨骼肌）或完全（心肌、肝組織）透化。這種方法可能無法獲得完整的活細胞。部分透化的樣品需額外的化學透化（皂苷或洋地黃苷），通過標準化的孵育條件使線粒體外膜和內膜保持完好無損。在僅僅是機械滲透的組織中，必須通過在氧化磷酸化狀態下的呼吸中添加皂苷或洋地黃苷來檢查樣品是否完全透化。在這些條件下，完全透化的細胞預計不會有呼吸刺激。

3. 在每次實驗中測量1-2 mg組織的耗氧量需要高分辨率的呼吸測量。儀器對O2k的檢測極限為1pmolO2∙-1∙mL-1，直到空氣飽和。

4. 按照標準程序，實驗前組織樣品的穩定性通常是足夠的。通過將組織樣品保存在細胞保存培養基中可延長其穩定性。因為一些細胞在組織取樣期間被透化，可將透化后的樣品儲存時間最小化，或透化后保存在細胞保存培養基中以延長儲存時間。

呼吸檢測中樣品制備的穩定性取決于高質量線粒體呼吸介質的應用。高穩定性允許應用復雜的和擴展的底物-解偶聯抑制劑滴定（SUIT）方案。