模式小鼠在揭示血小板線粒體氧化損傷修復的新機制中的應用
盡管血小板是一種無核血細胞，但它們擁有線粒體。線粒體含有DNA，被兩個脂質雙層膜包圍[1]。線粒體作為細胞的動力源，參與調控血小板新陳代謝、ATP產生、血小板活化和細胞凋亡[2,3]。在正常生理條件下，細胞DNA和核苷酸庫不斷暴露于活性氧（ROS），從而發(fā)生氧化損傷，導致氧化核苷酸的生成[4]。Human MutT Homolog 1（MTH1）是一種核苷酸焦磷酸酶，可水解氧化的核苷酸，參與DNA損傷修復過程[5]。但關于MTH1在血小板中的表達和功能作用尚不清楚。
2023年8月10日，徐州醫(yī)科大學血液病研究所喬建林/徐開林/曾令宇團隊在《Nature Communications》上發(fā)表了題為“MTH1 protects platelet mitochondria from oxidative damage and regulates platelet function and thrombosis”的研究論文，揭示了血小板線粒體氧化損傷修復的新機制[6]。碩士研究生丁洋洋、桂翔和褚翔為論文共同第一作者，喬建林教授、徐開林教授和曾令宇教授為論文共同通訊作者。
研究材料
MTH1flox/flox小鼠（賽業(yè)生物定制）、PF4-CRE小鼠和野生型小鼠
研究方法
流式細胞術、動脈血栓模型，深靜脈血栓模型、出血模型、蛋白印跡、定量磷酸化蛋白組學、免疫熒光等。
技術路線
01MTH1fl/fl和MTH1fl/fl PF4-Cre小鼠
02體內出血和血栓模型
03體外血小板功能檢測
04體外血小板線粒體氧化損傷檢測
05定量磷酸化蛋白組學檢測差異蛋白磷酸化
06檢測線粒體基因編碼蛋白表達
研究結果
1.血小板表達MTH1，且其缺失顯著抑制血小板參與體內止血和血栓形成
為探索MTH1是否在血小板內表達，研究人員使用不同抗體及免疫電鏡證實MTH1在血小板內表達，且定位在線粒體中（圖1）。為進一步研究其在血小板功能和血栓形成中的作用，研究人員使用賽業(yè)生物定制MTH1flox/flox小鼠構建了巨核細胞/血小板特異性MTH1敲基因小鼠，發(fā)現(xiàn)血小板MTH1缺失小鼠體內止血和動靜脈血栓形成顯著受損。
圖1 MTH1在血小板中的表達及在止血和血栓中的作用[6]
2.MTH1敲除顯著抑制GPCR介導的血小板聚集、鈣動員和線粒體ATP產生
為探索MTH1對體外血小板功能的影響，研究者分離血小板，使用不用激活劑來刺激血小板，發(fā)現(xiàn)，MTH1缺失顯著降低了凝血酶（GPCR受體的激動劑）介導的血小板活化、聚集能力、鈣離子動員、促凝活性和線粒體ATP產生（圖2），但不影響膠原相關多肽（CRP）（GPVI受體的激動劑）介導的血小板功能。
圖2 MTH1對血小板聚集、顆粒釋放、aIIbb3活化、鈣動員和線粒體ATP的影響[6]
3.MTH1缺失顯著增加血小板活化后線粒體的氧化損傷
進一步分析發(fā)現(xiàn)，MTH1缺失顯著增加了凝血酶而不是 CRP誘導的血小板線粒體氧化損傷。其原因是凝血酶而不是CRP可誘導血小板線粒體ROS產生，進而引起線粒體氧化損傷（圖3）。
圖3 MTH1對血小板線粒體氧化損傷的影響[6]
4.MTH1敲除影響血小板活化后眾多蛋白的磷酸化
為進一步探索MTH1對血小板信號通路的影響，研究者進行了定量磷酸化蛋白組學分析，鑒定到多種具有顯著差異的磷酸化蛋白，KEGG分析發(fā)現(xiàn)這些差異的磷酸化蛋白主要富集在血小板活化、MAPK和Rap1信號通路。此外，顯著差異的磷酸化蛋白中有2個定位于線粒體，一個參與調控線粒體代謝（Slc25a1），另一個參與調控線粒體蛋白合成（Slirp）（圖4）。
圖4 定量磷酸化蛋白組學分析[6]
5.MTH1敲除顯著下調MT-CO1的表達
由于MTH1參與DNA氧化損傷，其缺失可能影響DNA的轉錄、蛋白翻譯和合成等，研究人員接下來檢測了MTH1缺失對線粒體蛋白合成和表達的影響，發(fā)現(xiàn)線粒體基因編碼的蛋白MT-CO1（細胞色素C氧化酶I，線粒體氧化呼吸鏈復合物4的主要亞基）的蛋白和基因表達水平在刺激后的MTH1敲除血小板中顯著降低（圖5），而核基因組編碼的蛋白表達水平并未顯著改變。MT-CO1表達的降低主要原因是在所有線粒體DNA中，MT-CO1基因中G堿基含量最高，而MTH1的主要功能參與修復氧化的G堿基，這樣將導致MTH1缺失后無法修復氧化的堿基，進而使MT-CO1的表達顯著降低。
圖5 MTH1敲除后引起MT-CO1水平的降低[6]
6.MTH1在人血小板中發(fā)揮相同作用
為驗證MTH1是否在人血小板發(fā)揮相同作用，研究者使用了MTH1抑制劑TH588，結果發(fā)現(xiàn)抑制人血小板MTH1顯著降低了凝血酶而不是CRP誘導的血小板功能。此外，抑制人血小板MTH1顯著增加了凝血酶誘導的血小板線粒體氧化損傷（圖6）。
圖6 MTH1在人血小板功能中的作用[6]
研究結論
本研究利用巨核細胞/血小板特異性MTH1敲基因小鼠及定量磷酸化蛋白組學等方法，發(fā)現(xiàn)MTH1對血小板線粒體氧化應激發(fā)揮保護作用并參與調控G蛋白偶聯(lián)受體（GPCR）介導的血小板功能和血栓形成，提示MTH1可能是預防血栓性疾病的潛在治療靶點。
參考文獻：
[1]Melchinger H, Jain K, Tyagi T, Hwa J. Role of Platelet Mitochondria: Life in a Nucleus-Free Zone. Front Cardiovasc Med 6, 153 (2019).
[2]Kholmukhamedov A, Jobe S. Platelet respiration. Blood Adv 3, 599-602 (2019).
[3]Hayashi T, Tanaka S, Hori Y, Hirayama F, Sato EF, Inoue M. Role of mitochondria in the maintenance of platelet function during in vitro storage. Transfus Med 21, 166-174 (2011).
[4]Lindahl T. Instability and decay of the primary structure of DNA. Nature 362, 709-715 (1993).
[5]Nakabeppu Y. Molecular genetics and structural biology of human MutT homolog, MTH1. Mutat Res 477, 59-70 (2001).
[6]Ding Y, Gui X, Chu X, Sun Y, Zhang S, Tong H, Ju W, Li Y, Sun Z, Xu M, Li Z, Andrews RK, Gardiner EE, Zeng L, Xu K, Qiao J. MTH1 protects platelet mitochondria from oxidative damage and regulates platelet function and thrombosis. Nat Commun. 2023 Aug 10;14(1):4829.
賽業(yè)小鼠模型構建
Nudt1 flox小鼠（Mth1 flox小鼠）
小鼠福利，限定發(fā)放中~
品系名稱：
C57BL/6J-Nudt1em1Cflox/Cya
品系編號：
CKOCMP-17766-Nudt1-B6J-VA
產品編號：
S-CKO-03821
應用方向：
代謝,腫瘤,呼吸系統(tǒng),消化系統(tǒng),糖代謝,線粒體研究,水解酶,RNA結合蛋白
打靶方案：
參考文獻：
[1]Melchinger H, Jain K, Tyagi T, Hwa J. Role of Platelet Mitochondria: Life in a Nucleus-Free Zone. Front Cardiovasc Med 6, 153 (2019).
[2]Kholmukhamedov A, Jobe S. Platelet respiration. Blood Adv 3, 599-602 (2019).
[3]Hayashi T, Tanaka S, Hori Y, Hirayama F, Sato EF, Inoue M. Role of mitochondria in the maintenance of platelet function during in vitro storage. Transfus Med 21, 166-174 (2011).
[4]Lindahl T. Instability and decay of the primary structure of DNA. Nature 362, 709-715 (1993).
[5]Nakabeppu Y. Molecular genetics and structural biology of human MutT homolog, MTH1. Mutat Res 477, 59-70 (2001).
[6]Ding Y, Gui X, Chu X, Sun Y, Zhang S, Tong H, Ju W, Li Y, Sun Z, Xu M, Li Z, Andrews RK, Gardiner EE, Zeng L, Xu K, Qiao J. MTH1 protects platelet mitochondria from oxidative damage and regulates platelet function and thrombosis. Nat Commun. 2023 Aug 10;14(1):4829.
