本次和大家見面的是脊髓性肌萎縮癥（SMA）模型——B6-hSMN2(SMA)小鼠，先讓小賽帶大家了解一下SMA。

SMA是由脊髓前角細胞運動神經元變性引起的常染色體隱性遺傳病，以嚴重進行性肌無力和肌萎縮為特征，是嬰幼兒期常見的致死性罕見遺傳病。SMA全球發病率為1/6,000~1/10,000，在罕見病中屬較高水平，也被稱為罕見病中的“常見病”^[1]。

多數SMA由SMN1突變導致
SMA與生存運動神經元（SMN）蛋白有關，該蛋白缺乏會在脊髓運動神經元中導致廣泛的剪接缺陷和功能缺失。人體SMN編碼基因分為SMN1和SMN2，SMN1通過轉錄和翻譯生成完整功能性蛋白，是體內SMN蛋白的主要來源。SMN2與SMN1高度保守，但在7號外顯子剪接增強子處存在一個核苷酸差異，導致生成的多數SMN2 mRNA缺少第7個外顯子，編碼功能缺失的SMN截斷蛋白，并在細胞內迅速降解^[2,3]。僅有部分SMN2 Pre-mRNA（10~15%）能被剪切為全長mRNA，編碼具有正常功能的SMN蛋白（圖1）。
 

圖1 SMN2基因編碼的少量功能性SMN蛋白無法完全代償SMN1基因的缺失^[3]

約95%的SMA患者攜帶SMN1第7號外顯子純合缺失突變或使SMN1轉為SMN2的突變，SMN2表達無法代償體內SMN蛋白的缺失，進而影響運動、呼吸和吞咽并累及脾臟、心臟和胰腺等器官，甚至威脅生命。在SMN1缺失的情況下，根據患者體內SMN2的拷貝數，可將SMA分為0~Ⅳ型。Ⅰ型SMA患者具有2個SMN2拷貝，Ⅱ型SMA患者具有3個SMN2拷貝，Ⅲ型和Ⅳ型SMA患者具有更多SMN2拷貝。一般來講，患者體內SMN2拷貝數越多，疾病的嚴重程度越低，Ⅰ型SMA是較為嚴重的亞型，約占SMA總人群的60%^[4-5]。

SMA模型的構建策略
根據小鼠SMN基因特性（僅存在Smn1基因）和多數SMA的遺傳特性（SMN2不能代償SMN1的缺失），賽業生物將小鼠Smn1基因原位替換為人類SMN2基因，構建了SMN1缺失并表達人源SMN2（hSMN2）的Ⅰ型SMA模型（圖2）。
 

圖2 B6-hSMN2(SMA)小鼠基因編輯策略

這種策略模擬大部分SMA的遺傳特性，即SMN1純合缺失和SMN2雙拷貝。與敲除小鼠Smn1基因，并通過轉基因隨機插入若干拷貝SMN2基因的傳統策略相比，這種策略不存在SMN2基因隨機插入，小鼠擁有清晰的SMN2基因拷貝數并能穩定遺傳，符合大多數SMA的情況。此外，本模型可以與在6號染色體插入SMN2基因的Rosa26-hSMN2小鼠交配，增加小鼠體內SMN2拷貝以模擬不同SMA亞型。

B6-hSMN2(SMA)小鼠表達人源SMN2基因，不表達小鼠Smn1基因
與野生型對照組（B6N）相比，純合B6-hSMN2(SMA)小鼠不表達小鼠Smn1 mRNA（圖3 d），其體內同時存在缺少7號外顯子（E7-）及包含7號外顯子（E7+）的人類SMN2轉錄本（圖3 a-b），SMN2 E7+轉錄本僅占總SMN2轉錄本（E7+&E7-）的極少部分（圖3 c）。
 

圖3 3周齡B6-hSMN2(SMA)小鼠和野生型小鼠（B6N）基因表達檢測

B6-hSMN2(SMA)小鼠缺乏SMN蛋白
基因的改變影響了SMN蛋白水平，與野生型相比，純合B6-hSMN2(SMA)小鼠脊髓、心臟、骨骼肌、腦部、肝臟和腎臟中僅存在少量由SMN2基因編碼的SMN蛋白（圖4），這與人類SMA患者體內的蛋白表達模式相似。
 

圖4 3周齡野生型小鼠（C57BL/6N）和 B6-hSMN2(SMA)小鼠體內SMN蛋白檢測

B6-hSMN2(SMA)小鼠呈現多組織病理
組織學檢測結果表明，純合B6-hSMN2(SMA)小鼠顯示出肌細胞壞死和萎縮、胞質崩解、淋巴細胞浸潤和肌細胞間隔增寬/排列疏松等肌肉組織病理，局部肌纖維壞死溶解/結構消失、結締組織增生、粒細胞浸潤、掌骨斷裂和皮下水腫等腳掌和腳趾病理，以及局部皮下水腫、結締組織排列疏松、血管擴張、肌細胞萎縮并伴有少量淋巴細胞浸潤等尾部病理（圖5）。
 

圖5 3周齡純合B6-hSMN2(SMA)小鼠肌肉、腳掌和尾部可見明顯病理表型

B6-hSMN2(SMA)小鼠存在嚴重發育缺陷和漸進性疾病進程
SMN蛋白的缺失導致B6-hSMN2(SMA)小鼠發育出現缺陷，表現為肌肉萎縮、站立不穩、體型較小、身長較短、斷尾和四肢浮腫等嚴重表型（圖6）。
 

圖6 3周齡雜合B6-hSMN2(SMA)小鼠（hSMN2/+）和純合B6-hSMN2(SMA)小鼠（hSMN2/hSMN2）外觀

此外，純合B6-hSMN2(SMA)小鼠在第20天左右開始死亡，30天左右達到半數致死率。存活的純合B6-hSMN2(SMA)小鼠在30日齡左右出現腳趾壞死和完全斷尾的現象，50日齡左右出現耳朵壞死，66日齡耳朵周圍毛發變白（圖7）。雜合B6-hSMN2(SMA)小鼠與野生型相似，無異常情況，符合SMA患者的常染色體隱性遺傳模式。
 

圖7 B6-hSMN2(SMA)小鼠生存曲線和疾病進程

小核酸藥物減輕B6-hSMN2(SMA)小鼠疾病表型并提高生存率
目前有Zolgensma、Spinraza和Evrysdi三款SMA藥物獲批上市。Spinraza為首款獲批藥物，通過反義寡核苷酸（ASO）修飾SMN2 mRNA的剪切模式，使其生成大量包含7號外顯子的正常SMN2 mRNA以編碼功能性SMN蛋白，這也是SMA治療的主要方向之一^[3]。以Spinraza公開信息為基礎合成與其結構和功能類似的反義寡核苷酸（ASO10-27，由GenScript合成），并以腦室內注射（icv）和皮下注射（s.c.）的方式分別給予B6-hSMN2(SMA)小鼠不同劑量的ASO10-27。數據顯示，腦室內注射（icv）的ASO可以增加B6-hSMN2(SMA)小鼠腦部SMN蛋白表達量（圖8 a）和脊髓前角運動神經元個數（圖8 b）。
 

圖8 靶向SMN2的ASO對B6-hSMN2(SMA)小鼠SMN蛋白和運動神經元的影響

通過腦室內注射（icv）方式給藥的B6-hSMN2(SMA)小鼠生存率明顯提升，小鼠在78日齡仍保持存活。未經ASO治療的B6-hSMN2(SMA)小鼠在35日齡出現腳趾壞死和斷尾，ASO治療組小鼠僅在43日齡出現腳趾輕微腫脹，未見腳趾壞死且尾巴尚存。在78日齡，部分ASO處理組小鼠才出現斷尾現象，但仍未見腳趾壞死（圖9）。
 

圖9 ASO處理提升B6-hSMN2(SMA)小鼠存活率并延緩組織病變

總 結
綜上所述，B6-hSMN2(SMA)小鼠表達人類SMN2基因，并存在SMN2 mRNA的選擇性剪切，這導致小鼠體內SMN蛋白的缺失，引起與經典SMA模型相似的表型。ASO、siRNA和miRNA等小核酸作為最近幾年快速發展新興藥物，因其通過靶向mRNA而非基因來治療疾病，不存在遺傳風險，因此受到眾多關注，尤其是遺傳性罕見病領域。B6-hSMN2(SMA)小鼠模擬人類SMA的遺傳機制和疾病進程，對靶向SMN2的ASO藥物具有良好響應，表明本模型可用于靶向SMN2的小核酸及其它類型藥物的開發、篩選和評價等研究。