細胞轉(zhuǎn)染方法及影響因素
細胞轉(zhuǎn)染是指將外源分子如 DNA RNA 等導入真核細胞的技術。可分為瞬時轉(zhuǎn)染，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染等。
瞬時轉(zhuǎn)染是指外源 DNA/RNA 不整合到宿主染色體中，因此一個宿主細胞可存在多個拷貝數(shù)，產(chǎn)生高水平的表達，但通常只持續(xù)幾天，多用于啟動子和其他調(diào)控元件的分析。一般來說，超螺旋質(zhì)粒 DNA 轉(zhuǎn)染效率較高，在轉(zhuǎn)染后 24-72h內(nèi)分析結果，常常用到一些報告系統(tǒng)如熒光蛋白，β半乳糖苷酶等來幫助檢測。
穩(wěn)定轉(zhuǎn)染是指外源 DNA 既可以整合到宿主染色體中，也可能作為一種游離體存在。盡管線性 DNA 比超螺旋 DNA 轉(zhuǎn)入量低但整合率高。外源 DNA 整合到染色體中概率很小，通常需要一些選擇性標記反復篩選得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的同源細胞系。
主要有下面幾種方法：
化學法：磷酸鈣法、DEAE-右旋糖苷法、陽離子脂質(zhì)體法；
物理法：電穿孔法、顯微注射法、biolistic 顆粒傳遞法；
病毒介導法：逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒。
A. 陽離子脂質(zhì)體法：帶正電的脂質(zhì)體與核酸帶負電的磷酸基團形成復合物被細胞內(nèi)吞。
特點：簡單通用，適用性廣，轉(zhuǎn)染效率高，重復性好，但轉(zhuǎn)染時需除血清，轉(zhuǎn)染效率隨細胞類型變化大。由于脂質(zhì)體復合物與貼壁細胞的接觸機會遠大于懸浮細胞，所以貼壁比懸浮轉(zhuǎn)染效率要高。懸浮細胞建議使用電穿孔法。
B. 電穿孔法：利用高壓電脈沖對細胞膜的干擾，使其形成利于核酸進入的微孔。
C. 逆轉(zhuǎn)錄病毒(RNA)：通過病毒中膜糖蛋白和宿主細胞表面的受體相互作用進入宿主細胞，之后反轉(zhuǎn)錄酶啟動合成 DNA 并隨機整合到宿主基因組中。
特點：穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，可用于難轉(zhuǎn)染的細胞、原代細胞，體內(nèi)細胞等，但攜帶基因不能太大。
D. 腺病毒(雙鏈 DNA)：先和細胞表面的受體結合，繼而在αV 整合素介導下被細胞內(nèi)吞。
特點：可用于難轉(zhuǎn)染的細胞。
影響轉(zhuǎn)染的因素：
1、血清
血清影響復合物的形成，降低轉(zhuǎn)染效率。
陽離子脂質(zhì)體和 DNA 的最佳量在使用血清時會有所不同，因此想在轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基中加入血清時要進行條件優(yōu)化。大部分細胞可以在無血清培養(yǎng)基中幾個小時內(nèi)保持健康，對于對血清缺乏比較敏感的細胞，可以使用 OPTI-MEM I 培養(yǎng)基。對于對血清缺乏比較敏感的貼壁細胞，建議使用 LIPOFECTAMINE 2000。
2、抗生素
比如青霉素和鏈霉素，是影響轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)基添加物。這些抗生素一般對于真核細胞無毒，但陽離子脂質(zhì)體試劑增加了細胞的通透性，使抗生素可以進入細胞。這降低了細胞的活性，導致轉(zhuǎn)染效率低。
3、細胞代數(shù)
轉(zhuǎn)染前細胞最好經(jīng)過 1-2 次傳代保證細胞生長旺盛容易轉(zhuǎn)染，注意貼壁細胞一旦長滿就不好轉(zhuǎn)染。
4、細胞鋪板密度
一般轉(zhuǎn)染時，貼壁細胞密度為 70%-90%，懸浮細胞密度為 2*10^6--4*10^6 細胞/ml 時效果較好。確保轉(zhuǎn)染時細胞沒有長滿或處于靜止期。鋪板細胞數(shù)目的增加可以增加轉(zhuǎn)染活性和細胞產(chǎn)量。
5、DNA 質(zhì)量
DNA 質(zhì)量對轉(zhuǎn)染效率影響非常大。一般的轉(zhuǎn)染技術基于電荷吸引原理，如果 DNA 不純，如帶少量的鹽離子，蛋白，代謝物污染都會顯著影響轉(zhuǎn)染復合物的有效形成和轉(zhuǎn)染的進行。
瞬時轉(zhuǎn)染是指外源 DNA/RNA 不整合到宿主染色體中，因此一個宿主細胞可存在多個拷貝數(shù)，產(chǎn)生高水平的表達，但通常只持續(xù)幾天，多用于啟動子和其他調(diào)控元件的分析。一般來說，超螺旋質(zhì)粒 DNA 轉(zhuǎn)染效率較高，在轉(zhuǎn)染后 24-72h內(nèi)分析結果，常常用到一些報告系統(tǒng)如熒光蛋白，β半乳糖苷酶等來幫助檢測。
穩(wěn)定轉(zhuǎn)染是指外源 DNA 既可以整合到宿主染色體中，也可能作為一種游離體存在。盡管線性 DNA 比超螺旋 DNA 轉(zhuǎn)入量低但整合率高。外源 DNA 整合到染色體中概率很小，通常需要一些選擇性標記反復篩選得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的同源細胞系。
主要有下面幾種方法：
化學法：磷酸鈣法、DEAE-右旋糖苷法、陽離子脂質(zhì)體法；
物理法：電穿孔法、顯微注射法、biolistic 顆粒傳遞法；
病毒介導法：逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒。
A. 陽離子脂質(zhì)體法：帶正電的脂質(zhì)體與核酸帶負電的磷酸基團形成復合物被細胞內(nèi)吞。
特點：簡單通用，適用性廣，轉(zhuǎn)染效率高，重復性好，但轉(zhuǎn)染時需除血清，轉(zhuǎn)染效率隨細胞類型變化大。由于脂質(zhì)體復合物與貼壁細胞的接觸機會遠大于懸浮細胞，所以貼壁比懸浮轉(zhuǎn)染效率要高。懸浮細胞建議使用電穿孔法。
B. 電穿孔法：利用高壓電脈沖對細胞膜的干擾，使其形成利于核酸進入的微孔。
C. 逆轉(zhuǎn)錄病毒(RNA)：通過病毒中膜糖蛋白和宿主細胞表面的受體相互作用進入宿主細胞，之后反轉(zhuǎn)錄酶啟動合成 DNA 并隨機整合到宿主基因組中。
特點：穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，可用于難轉(zhuǎn)染的細胞、原代細胞，體內(nèi)細胞等，但攜帶基因不能太大。
D. 腺病毒(雙鏈 DNA)：先和細胞表面的受體結合，繼而在αV 整合素介導下被細胞內(nèi)吞。
特點：可用于難轉(zhuǎn)染的細胞。
影響轉(zhuǎn)染的因素：
1、血清
血清影響復合物的形成，降低轉(zhuǎn)染效率。
陽離子脂質(zhì)體和 DNA 的最佳量在使用血清時會有所不同，因此想在轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基中加入血清時要進行條件優(yōu)化。大部分細胞可以在無血清培養(yǎng)基中幾個小時內(nèi)保持健康，對于對血清缺乏比較敏感的細胞，可以使用 OPTI-MEM I 培養(yǎng)基。對于對血清缺乏比較敏感的貼壁細胞，建議使用 LIPOFECTAMINE 2000。
2、抗生素
比如青霉素和鏈霉素，是影響轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)基添加物。這些抗生素一般對于真核細胞無毒，但陽離子脂質(zhì)體試劑增加了細胞的通透性，使抗生素可以進入細胞。這降低了細胞的活性，導致轉(zhuǎn)染效率低。
3、細胞代數(shù)
轉(zhuǎn)染前細胞最好經(jīng)過 1-2 次傳代保證細胞生長旺盛容易轉(zhuǎn)染，注意貼壁細胞一旦長滿就不好轉(zhuǎn)染。
4、細胞鋪板密度
一般轉(zhuǎn)染時，貼壁細胞密度為 70%-90%，懸浮細胞密度為 2*10^6--4*10^6 細胞/ml 時效果較好。確保轉(zhuǎn)染時細胞沒有長滿或處于靜止期。鋪板細胞數(shù)目的增加可以增加轉(zhuǎn)染活性和細胞產(chǎn)量。
5、DNA 質(zhì)量
DNA 質(zhì)量對轉(zhuǎn)染效率影響非常大。一般的轉(zhuǎn)染技術基于電荷吸引原理，如果 DNA 不純，如帶少量的鹽離子，蛋白，代謝物污染都會顯著影響轉(zhuǎn)染復合物的有效形成和轉(zhuǎn)染的進行。
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