胰腺導管腺癌（PDAC）很難在前期發現，因為它在無癥狀階段進展迅速，能早期轉移到遠處器官。導致PDAC預后不良的主要特征之一是結締組織增生，其形式為廣泛致密的纖維基質和過量的細胞外基質（ECM）。在ECM中，基質金屬蛋白酶（MMPs）由胰腺星狀細胞（PSCs）和癌細胞分泌。在MMPs的幾種亞型中，MMP2主要與促進細胞生長和侵襲有關。

最近的研究表明，二甲雙胍是一種具有出色安全性的一線抗糖尿病藥物，可以在減少癌癥干細胞（CSCs）的數量和各種癌細胞的遷移能力方面發揮作用。例如，在胰腺癌，乳腺癌、卵巢癌和黑色素瘤中，二甲雙胍已被證明可以在體外和體內抑制腫瘤狀態。鑒于其安全性和低成本，二甲雙胍輔助治療可能是改善PDAC預后的一個有吸引力的選擇。然而，對其益處機制的研究主要局限于細胞系，這些細胞系無法重現胰腺腫瘤微環境。

在胰腺中，PSCs是促進腫瘤微環境中結締組織增生反應的中樞細胞。既往研究報道，調控PSCs可改善PDAC的治療效果。因此，有理由將具有豐富基質的PSCs作為PDAC的重要治療靶點，這些基質有助于化學耐藥性和高侵襲性。

最近，在韓國成均館大學醫學院三星醫學中心內分泌與代謝系、肝膽胰腺外科系以及大邱慶北醫療創新基金會的一項聯合研究中，著手確定了二甲雙胍在臨床相關濃度下的抗癌作用是否可以在由患者來源的PDAC類器官和從術后組織獲得的原代人PSCs制成的PDAC三維（3D）共培養模型中得到證明。利用該模型，實驗探索了二甲雙胍對PSCs的抗遷移作用的關鍵機制是否是由MMP2下調，以及口服二甲雙胍（30 mg/kg）是否可以抑制免疫抑制小鼠PDAC類器官異種移植的生長。相關內容發表在 The American Journal of Cancer Research 期刊題為“Anti-cancer effects of metformin in a 3D co-culture model of pancreatic ductal adenocarcinoma”。

首先，為了在體外探索人PDAC的表型，從人PDAC組織中分離出PSCs和PDAC類器官。

為了檢測二甲雙胍是否會影響與人 PSCs 中遷移和侵襲相關基因的 mRNA 轉錄水平，在接種細胞一天后向 PSC 生長培養基中加入濃度為 1 μM、10 μM 和 100 μM 的二甲雙胍并處理 48 小時。結果表明，二甲雙胍處理的 PSCs 表現出波形蛋白、MMP2 和金屬蛋白酶2組織抑制劑（TIMP2）的表達水平降低，這是遷移和侵襲的關鍵因子。二甲雙胍劑量依賴性地降低了CD10、CD24和CD44的轉錄水平，這是各種腫瘤的基質預后標志物。基于定量PCR分析，檢查了濃度為10 μM二甲雙胍的PSCs的形態變化和細胞活力，發現對照組和二甲雙胍處理組之間在48小時內沒有顯著差異。

為了研究二甲雙胍是否可以抑制人PSCs的遷移能力，進行了細胞遷移測定。與對照和1 μM二甲雙胍相比，10 μM二甲雙胍顯著抑制細胞遷移形成的圓形無細胞區的封閉（圖1 A、B）。這些結果在不同N期PDAC患者的PSCs中是可重復的（圖1 C、D）。此外，研究了MMP2的蛋白質表達和酶活性。在不同N期PDAC患者的PSCs中，MMP2蛋白水平和酶活性在對照組和二甲雙胍組之間存在顯著差異（圖1 E、G）。二甲雙胍對CD10的蛋白質表達具有抑制作用，CD10是一種促進癌細胞進展的基質干細胞標志物（圖1 F）。這些數據表明，二甲雙胍可以抑制人類PSCs的遷移能力和MMP2和CD10的表達水平。
 

圖1   二甲雙胍抑制 PSCs 的遷移能力及其對 MMP2 和 CD10 的表達。

接下來，探討了轉化生長因子-β（TGF-β）信號通路（腫瘤遷移中的主要信號通路之一）在二甲雙胍降低PSCs中MMP2表達的能力中所起的作用。為了確認PSCs，PDAC類器官以及共培養的PSCs和PDAC類器官分泌TGF-β，將其培養48 h并檢測TGF-β的分泌。結果發現，二甲雙胍處理組分泌的TGF-β少于對照組。然后，為了確定二甲雙胍是否影響TGF-β信號分子，在二甲雙胍存在下向PSCs施用重組TGF-β，發現二甲雙胍降低了MMP2、磷酸化Smad 2/3和α-SMA的表達，它們與轉移中的TGF-β信號傳導有關。在二甲雙胍處理的 PSCs 中，給予重組 TGF-β 逆轉了 p-Smad2/3、α-SMA 和 MMP2 的衰減。此外進行了遷移測定，以確定二甲雙胍的抗遷移作用是否獨立于AMPK途徑，結果表明，二甲雙胍的抗遷移作用與AMPK依賴性途徑無關，二甲雙胍是通過TGF-β而非AMPK信號通路減弱PSCs的遷移能力

為了研究二甲雙胍如何影響人PDAC類器官，從術后組織中分離和培養了類器官，并觀察48小時（圖2 A），用EhtD-1和鈣黃綠素AM染色以評估細胞活力，發現對照組和二甲雙胍組沒有顯著差異（圖2 B）。細胞毒性和細胞增殖測定也未顯示差異（圖2 C）。然后研究了二甲雙胍是否會降低參與癌癥侵襲性相關的癌癥干細胞（CSC）標志物，發現癌癥干性標志物LGR5、CD24、CD44、CD133和EpCAM的mRNA轉錄本在N0期PDAC類器官中顯著降低（圖2 D）。在 N1 和 N2 期 PDAC 類器官中，LGR5 顯著降低（圖2 E、F）。在N0-N2期 PDAC 類器官中，CD24、CD44和EpCAM降低（圖2 D-F）。此外，二甲雙胍處理顯著降低了CSC標志物的蛋白表達水平（圖2 G）。這些結果表明，二甲雙胍誘導PDAC類器官中癌癥干性標志物的下調，而不影響細胞活力或增殖。

圖2   二甲雙胍抑制PDAC類器官腫瘤干性標志物的表達。

進一步地，為了概括人PDAC基質的腫瘤微環境，利用PDAC類器官和PSCs建立了體外3D直接共培養模型（圖3 A），PSCs包圍了PDAC類器官，而沒有干擾PDAC類器官的導管結構（圖3 B）。然后比較了有和沒有二甲雙胍處理的癌癥干性因子的mRNA轉錄水平。二甲雙胍在3D直接共培養模型中減弱了CD24、CD44、CD133和LGR5的基因和蛋白表達水平（圖3 C、D），這些發現在N1期和N2期PDAC類器官和PSCs中是一致的，表明PDAC類器官和PSCs的共同培養可以模擬人PDAC基質而不破壞導管結構，而且二甲雙胍可以作為輔助治療以減少癌癥干性因子。

圖3   在基質膠中PDAC類器官和PSCs的體外3D直接共培養。

此外，使用間接共培養系統檢查了二甲雙胍對PDAC 類器官和 PSCs 中癌癥侵襲和遷移標志物基因表達的影響。結果表明，二甲雙胍降低了上室PSCs中MMP2和TIMP2的基因表達，以及下室PDAC類器官中癌癥干性標志物CD24、CD44、CD133和LGR5 的表達。

然后，研究了MMP2在二甲雙胍對PSCs的抗遷移作用中的影響，使用間接共培養系統評估了向底部孔遷移的PSCs數量（圖4 A）。為了探究MMP2下調在二甲雙胍抗遷移作用中的影響，分別用MMP2 siRNA或對照siRNA轉染PSCs，并使用間接3D共培養系統進行遷移測定。結果證實，用MMP2 siRNA轉染可顯著降低PSCs中MMP2的mRNA表達（圖4 B）。然后研究MMP2沉默的PSCs的遷移能力，發現MMP2沉默組向孔底遷移的PSCs數量明顯少于對照組（圖4 C、D）。在對照和MMP2沉默組中，二甲雙胍處理顯示出與單獨使用MMP2沉默組相同的結果（圖4 C、D）。此外，為了探索MMP2是否可以促進PSCs的遷移和侵襲能力，在培養基中添加了rhMMP2。與對照組相比，rhMMP2處理導致更增強的遷移能力。在rhMMP2組中，二甲雙胍處理與對照組一樣減弱了增強的遷移（圖4 C、D）。這些結果表明，二甲雙胍通過靶向MMP2對PSCs發揮抗遷移作用。

圖4   體外3D遷移模型中MMP2敲低對PSC遷移能力的影響。

最后，研究了臨床相應劑量的抗高血糖藥物二甲雙胍是否會影響裸鼠皮下植入PDAC類器官的腫瘤生長，對異種移植小鼠以每天30 mg/kg口服二甲雙胍，持續28天，對照組注射無菌水。結果表明，二甲雙胍的給藥明顯減小了腫瘤體積。此外，二甲雙胍組的平均腫瘤重量明顯低于對照組，而且二甲雙胍組異種移植腫瘤的大小在視覺上小于對照組。二甲雙胍給藥28天后，癌癥干性和增殖標志物，如CD24、CD44、CD133和Ki67的mRNA水平顯著降低。這些數據表明，二甲雙胍抑制PDAC腫瘤異種移植物在體內的生長。

總之，二甲雙胍的抗癌作用可在使用患者來源的PDAC類器官和人原代PSCs制成的PDAC的3D直接和間接共培養模型中得到證實。此外，在異種移植模型中觀察到二甲雙胍的抗癌作用。該研究結果表明，二甲雙胍對PSCs的抗遷移作用的關鍵機制是通過MMP2下調發生的，這與TGF-β信號的下調有關；二甲雙胍處理還可以減弱單獨培養或與 PSCs 共培養的 PDAC 類器官的癌癥干性。這種抗癌作用是可以通過使用與2型糖尿病患者相當劑量的臨床相關的二甲雙胍濃度來實現的。

參考文獻：Hahn S, Oh BJ, Kim H, Han IW, Shin SH, Kim G, Jin SM, Kim JH. Anti-cancer effects of metformin in a 3D co-culture model of pancreatic ductal adenocarcinoma. Am J Cancer Res. 2023 May 15;13(5):1806-1825. PMID: 37293149; PMCID: PMC10244103.
原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/37293149/

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