乳腺腫瘤微環境（TME）內的機械力是癌癥進展的有效調節因子。隨著乳腺腫瘤的生長，各種生物力學在TME中積累，造成了腫瘤內部的壓縮增加，外圍張力增加以及整個腫瘤體積的間質液流動改變的復雜情況，這些力通過調控侵襲和轉移級聯影響癌癥進展。此外，研究表明，生物力學力通過癌細胞-免疫細胞信號串擾調節免疫反應。

盡管TME內存在多種細胞-細胞信號傳導機制，但外泌體在調節腫瘤進展中發揮了關鍵作用，可以通過調節免疫細胞活性來促進癌細胞免疫逃逸，從而促進易于腫瘤發展的環境。此外，研究表明，生物力學力可能具有通過TME內外泌體介導的信號傳導直接或間接調節細胞成分的潛力。

有幾種仿生體外系統可用于確定機械力對癌細胞的影響。微流體和Transwell系統通過調節趨化因子和蛋白質表達提供了對血流介導的乳腺癌（BCa）細胞信號傳導的見解。其他采用壓縮的體外系統已顯示，BCa細胞響應壓縮力通過細胞骨架重排增強其遷移。恒定張力下的三陰性乳腺癌（TNBC）細胞系通過FAK-Rho-ERK介導的信號增強其增殖和侵襲潛力。雖然這些體外研究已經解決了恒定流量或恒定細胞張力如何直接影響癌細胞，但尚未解決這些機械力是否有助于體內免疫抑制。此外，惡性BCa細胞中的機械力，外泌體釋放和免疫反應之間的直接聯系尚未得到研究。

來自美國阿拉巴馬大學伯明翰分校醫學系、病理學系、機械工程系課題組的一項研究曾報告了機械應變能明顯改變BCa細胞的蛋白質組學特征并能增強外泌體的產生，所產生的外泌體能夠直接促進惡性腫瘤細胞的生長，并誘導腫瘤微環境中的免疫抑制及改變免疫細胞的極化。相關研究成果發表在Laboratory Investigation期刊，題為“Mechanical strain induces phenotypic changes in breast cancer cells and promotes immunosuppression in the tumor microenvironment”。
 

振蕩應變促進BCa細胞增殖和遷移

首先，為了確定體外機械應變是否調節BCa細胞的增殖，利用體外張力系統，參數為0.3 Hz，10%單軸振蕩應變（Oscillatory strain，OS） 48小時，10% 恒定應變（Constant strain，CS）48小時，或無應變48小時，然后將MCF-7細胞（人ER+），MDA-MB-231細胞（人TNBC）和4T1.2細胞（小鼠TNBC）暴露于恒定或振蕩應變，并評估細胞增殖。結果表明，暴露于OS的MCF-7細胞與對照細胞或CS細胞相比增殖增加（圖1 a）。與對照細胞相比，暴露于CS和OS下的MDA-MB-231和4T1.2細胞的增殖都有所增加（圖1 b-c）；暴露于OS增強了ER+和TNBC（人和小鼠）細胞的遷移潛力（圖1 d-f）；暴露于CS僅增加人TNBC細胞的Transwell遷移和傷口愈合（圖1 e）。這些數據表明，振蕩應變促進ER+和TNBC細胞的增殖和遷移。
 

圖1   BCa細胞的增殖和遷移響應機械應變而變化。

機械應變改變BCa細胞產生的外泌體

為了研究機械應變是否調節BCa細胞的外泌體產生，將MCF-7細胞、MDA-MB-231細胞和4T1.2細胞暴露于OS 48小時，并從條件培養基中分離腫瘤來源的外泌體（TEXs）。 結果表明，OS暴露的人和小鼠TNBC細胞的條件培養基中的外泌體濃度顯著高于對照細胞，而OS不會改變ER+ 細胞的TEX產生，而且外泌體之間的平均大小在組間沒有顯著差異。此外，外泌體濃度與暴露于OS后在人和小鼠TNBC細胞中觀察到的增殖增加呈正相關。

目前尚不清楚增加的外泌體產量是否導致更高的增殖，或者更高的增殖是否導致外泌體的產生增加。為了解決這個問題，進行了共培養實驗，將暴露或不暴露于OS 48小時的 MCF-7細胞，MDA-MB-231細胞和4T1.2細胞在存在或不存在源自癌細胞外泌體的情況下共培養，評估細胞增殖。結果沒有觀察到與來自對照細胞的外泌體共培養和與來自暴露于OS癌細胞的外泌體共培養之間的癌細胞增殖顯著差異。因此，外泌體產生的增加不會導致更高的增殖，這表明更高的增殖可能導致研究中注意到的外泌體產生的增加。

振蕩應變改變BCa細胞的免疫調節外泌體譜

Tetraspanins、CD63、CD81、CD9 和 ESCRT-I 復合物亞基TSG101 是公認的標志物，可共同識別來自其他類型細胞外囊泡（EVs）的外泌體。暴露于OS的MCF-7細胞釋放的TEXs的表征顯示CD63+ 外泌體的頻率增加，CD81+ 外泌體的頻率降低。人和小鼠TNBC細胞產生的外泌體的Tetraspanin譜沒有顯著變化。此外，免疫調節蛋白（如免疫檢查點PD-L1）和賦予外泌體侵襲潛力的蛋白（如EpCAM和CD54）在外泌體上的存在開始在促進免疫抑制、腫瘤侵襲和轉移方面受到重視。當評估這些標志物時，暴露于OS的小鼠4T1.2細胞CD81+ PD-L1+ 和CD63+ PD-L1+ 外泌體的數量增加，而CD63+ CD54+ 外泌體的數量降低。這些發現表明，振蕩應變調節TNBC細胞產生PD-L1+ 外泌體。

振蕩應變促進TNBC原位模型中的腫瘤生長

接下來，為了確定OS是否促進體內腫瘤生長，利用BCa的同源原位小鼠模型來監測腫瘤大小和免疫細胞的浸潤。如圖2 a，與移植未應變的細胞相比，移植4T1.2細胞的小鼠暴露于OS在第8天和第11天顯示腫瘤生長顯著增加。

由于異質性髓源性抑制細胞（MDSC）和腫瘤相關巨噬細胞具有腫瘤促進功能，并且是腫瘤相關免疫抑制的驅動因素，因此進一步研究了機械應變誘導的腫瘤細胞變化是否改變了乳腺TME以調節這些免疫抑制細胞的浸潤，從而進一步促進腫瘤生長。腫瘤組織的免疫分析顯示，移植4T1.2細胞的小鼠暴露于OS在第14天TME中單核細胞MDSC亞群的百分比顯著增加（圖2 b）。腫瘤浸潤性粒細胞在兩組間的 MDSC 亞群無差異（圖2 c）。此外，移植4T1.2細胞的小鼠暴露于OS后TME中募集的巨噬細胞的浸潤增加（圖2 d）。值得注意的是，CD8+ T細胞的百分比在這些小鼠的TME中顯示出下降的趨勢（圖2 e）。這些結果表明，振蕩應變通過TME中的免疫抑制促進腫瘤生長。

圖2   振蕩力促進體內TME中的腫瘤生長和免疫抑制。

振蕩應變通過TME中的免疫抑制細胞調節外泌體的內化

然后進一步研究腫瘤細胞來源的外泌體是否被免疫細胞內化以調節體內的免疫抑制。結果表明，在乳腺腫瘤細胞上應用OS不僅可以增強腫瘤細胞-外泌體的分泌，還可以通過MDSCs和募集的巨噬細胞內化TEXs促進MDSCs和巨噬細胞的浸潤，從而調節TME中的免疫抑制。

TME中免疫細胞和腫瘤細胞的外泌體內化

最后研究了TEXs是否被TME中的免疫細胞和腫瘤細胞內化。在注射外泌體后的第2天（圖3 a）和第8天（圖3 a），TME中免疫細胞內化的外泌體被鑒定為PKH67+ CD45+ 細胞，而腫瘤細胞內化的外泌體被鑒定為PKH67+ CD45 陰性細胞（圖3 b）。此外，在外泌體注射后第2天和第8天，在TME中檢測到各種免疫細胞的外泌體內化，包括募集的巨噬細胞（圖3 c）、M2巨噬細胞（圖3 d）、MDSCs（圖3 e-g）、 CD4+ T 細胞 （圖3 h）和CD8+ T細胞（圖3 i）。在外泌體+ 細胞中，MDSCs的頻率高于其他研究的免疫細胞群。這些結果表明，TEXs可以被TME中的免疫細胞和腫瘤細胞在體內內化。

圖3    TME中免疫細胞和腫瘤細胞內化外泌體。

總之，該研究的數據表明，暴露于機械應變會增強BCa細胞中的侵襲性和促腫瘤表型，從而通過改變腫瘤細胞的增殖和遷移潛力以及增加免疫抑制細胞內化的免疫調節外泌體的釋放來促進免疫抑制，從而促進TME中增強的免疫-腫瘤細胞串擾。進一步研究參與腫瘤進展的機械應力的潛在機制的努力可能為靶向TME提供新的治療方法。

參考文獻：Wang Y, Goliwas KF, Severino PE, Hough KP, Van Vessem D, Wang H, Tousif S, Koomullil RP, Frost AR, Ponnazhagan S, Berry JL, Deshane JS. Mechanical strain induces phenotypic changes in breast cancer cells and promotes immunosuppression in the tumor microenvironment. Lab Invest. 2020 Dec;100(12):1503-1516. doi: 10.1038/s41374-020-0452-1. Epub 2020 Jun 22. PMID: 32572176; PMCID: PMC7686122.
原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32572176/

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