一、 昆蟲表達(dá)系統(tǒng)概述
昆蟲表達(dá)體系是四大蛋白表達(dá)系統(tǒng)（原核細(xì)胞，酵母，昆蟲細(xì)胞，真核哺乳動(dòng)物表達(dá)體系）之一。昆蟲表達(dá)系統(tǒng)的原理是通過將轉(zhuǎn)移載體中的表達(dá)組件轉(zhuǎn)座到大腸桿菌中增殖的桿狀病毒穿梭載體上，提取穿梭質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞后，得到的子代病毒即為重組病毒。將病毒上清侵染昆蟲細(xì)胞，獲得表達(dá)的重組蛋白。

二、 昆蟲表達(dá)系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)流程
1. 把目的基因克隆至pFastBac系列載體產(chǎn)生重組質(zhì)粒
根據(jù)pFastBac系列載體的多克隆位點(diǎn)選擇合適的酶切位點(diǎn)，按照讀碼框插入目的基因序列。通過測序驗(yàn)證插入序列是否正確。
2. 轉(zhuǎn)化DH10Bac大腸桿菌
轉(zhuǎn)化pFastBac重組質(zhì)粒到DH10 Bac大腸桿菌中，37℃培養(yǎng)48小時(shí)。可以選擇pFastBac1-EGFP作為對(duì)照質(zhì)粒。轉(zhuǎn)化后利用藍(lán)白斑篩選重組菌株。重組菌株由于轉(zhuǎn)座會(huì)導(dǎo)致LacZ基因的破壞而呈現(xiàn)白斑，用于藍(lán)白斑篩選的LB瓊脂糖平板應(yīng)含有50 μg/ml卡那霉素，7 μg/ml慶大霉素，10 μg/ml四環(huán)素，40 μg/ml X-gal和40 μg/ml IPTG。
3. 陽性驗(yàn)證（選做）
挑取白斑，重新劃線以確認(rèn)獲得的白色克隆是真實(shí)的白斑。平板含有50 μg/ml卡那霉素，7 μg/ml慶大霉素，10 μg/ml四環(huán)素，40 μg/ml X-gal和40 μg/ml IPTG，37℃培養(yǎng)過夜。
挑取白斑，培養(yǎng)過夜。須使用含有50 μg/ml卡那霉素，7 μg/ml慶大霉素和10 μg/ml四環(huán)素的LB培養(yǎng)液。
5. 重組bacmid質(zhì)粒提取
小量抽提試劑盒提取重組bacmid DNA。重組bacmid DNA應(yīng)該分裝凍存于-20℃，因?yàn)榉磸?fù)凍融會(huì)導(dǎo)致bacmid斷裂等從而顯著降低其轉(zhuǎn)化效率。如兩星期內(nèi)使用，可保存于4℃。
6. 重組bacmid的PCR鑒定
利用 PCR反應(yīng)對(duì)陽性克隆進(jìn)行進(jìn)一步的驗(yàn)證。PCR 反應(yīng)所用引物為pUC/M13 forward primer (5'-CCCAGTCACGACGTTGTAAAACG-3')，和pUC/M13 reverse primer (5'-AGCGGATAACAATTTCACACAGG-3')。沒有發(fā)生轉(zhuǎn)座的bacmid其所擴(kuò)增所產(chǎn)生的片段長度為350bp，重組bacmid擴(kuò)增所產(chǎn)生的片段的長度為350bp加上插入片段的長度。
7. 重組bacmid轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞
將提取的重組Bacmid轉(zhuǎn)染進(jìn)入昆蟲細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后，28℃培養(yǎng)24小時(shí)，細(xì)胞和細(xì)胞核開始變大；轉(zhuǎn)染后24-72小時(shí)，細(xì)胞慢慢停止生長、脫落，細(xì)胞表面長出芽孢狀結(jié)構(gòu)；轉(zhuǎn)染后72小時(shí)候細(xì)胞開始裂解，此時(shí)病毒開始釋放到培養(yǎng)液中。如果同時(shí)轉(zhuǎn)染了pFastBac1-EGFP，在轉(zhuǎn)染72小時(shí)后可以觀察到大部分細(xì)胞呈現(xiàn)綠色熒光，轉(zhuǎn)染后96小時(shí)幾乎所有的細(xì)胞都呈現(xiàn)綠色熒光，這樣可以作為整個(gè)病毒包裝體系的陽性對(duì)照。
8. 收集P1代桿狀病毒
轉(zhuǎn)染96小時(shí)后，收集培養(yǎng)液上清，500g離心5分鐘以沉淀細(xì)胞和細(xì)胞碎片，取上清即為P1代桿狀病毒。此時(shí)病毒滴度通常為1X10⁶-1X10⁷ pfu/ml。P1代病毒可短期保存于4℃，或分裝于含2% FBS的培養(yǎng)液中后在-80℃較長期保存。反復(fù)凍融會(huì)大大降低病毒活力，其滴度有可能降低10至100倍。
9. P1代桿狀病毒的擴(kuò)增
P1代病毒再次感染昆蟲細(xì)胞可獲得P2代病毒。如果采用懸浮培養(yǎng)的昆蟲細(xì)胞進(jìn)行病毒擴(kuò)增，建議使用10 ml培養(yǎng)液并且控制細(xì)胞密度為2X10⁶/ml；如果使用6孔板貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增，細(xì)胞密度應(yīng)為2X10⁶/well，MOI (multiplicity of infection)為0.05-0.1（即每100個(gè)細(xì)胞用5-10 pfu的病毒進(jìn)行感染）。28℃培養(yǎng)48-72小時(shí)后，70-80%的細(xì)胞死亡時(shí)，收集細(xì)胞和上清，500g離心5分鐘，取上清即為P2代病毒。此時(shí)病毒滴度約為1X10⁷-1X10⁸ pfu/ml。可收集本步驟離心后的細(xì)胞碎片沉淀，加入適量的1X SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液，裂解后進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳及Western blot檢測，以分析確定目的蛋白是否已經(jīng)正常表達(dá)。
10. 病毒感染昆蟲細(xì)胞進(jìn)行目的蛋白的大規(guī)模表達(dá)
可選擇Sf9/Sf1/HighFive的任何一種細(xì)胞株進(jìn)行蛋白大規(guī)模表達(dá)。但如果表達(dá)的是分泌蛋白，建議選用HighFive。建議在昆蟲細(xì)胞的對(duì)數(shù)生長期進(jìn)行病毒感染，此時(shí)細(xì)胞密度在1X10⁶/ml-2X10⁶/ml為佳，MOI可從5-10開始嘗試。建議在不同的時(shí)間階段，如感染后24、48、72或96小時(shí)收集細(xì)胞，裂解細(xì)胞，SDS-PAGE并進(jìn)行Western Blot檢測以確定最佳的停止蛋白表達(dá)的時(shí)間。因?yàn)槔ハx細(xì)胞內(nèi)有很多蛋白酶，表達(dá)時(shí)間過長會(huì)導(dǎo)致目的蛋白的降解。分泌蛋白的表達(dá)高峰通常在感染后30-72小時(shí)，而非分泌蛋白的表達(dá)高峰通常在感染后48-96小時(shí)。
11. 目的蛋白的純化
利用pFastBac1進(jìn)行目的蛋白的表達(dá)的時(shí)候，根據(jù)蛋白純化方式的需要以及融合表達(dá)目的蛋白以提高其表達(dá)量的需要，可以在質(zhì)粒構(gòu)建時(shí)添加His標(biāo)簽或GST標(biāo)簽。為了防止額外添加的His和GST等蛋白標(biāo)簽影響目的蛋白的生物學(xué)功能和結(jié)構(gòu)研究，可在融合蛋白和標(biāo)簽之間添加蛋白酶酶切位點(diǎn)，如TEV或PreScission的酶切位點(diǎn)。如果蛋白主要以可溶形式表達(dá)，離心收集昆蟲細(xì)胞，超聲裂解細(xì)胞，但由于昆蟲細(xì)胞內(nèi)蛋白酶種類比較多，需要添加各種蛋白酶抑制劑。離心收集超聲后上清，使用鎳柱或GST柱等純化目的蛋白。同時(shí)可以利用離子交換、分子篩層析等進(jìn)一步純化目的蛋白。純化獲得的蛋白，可以添加適量甘油后保存，或者如果有需要也可以適當(dāng)濃縮后保存等。
 
三、昆蟲表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)缺點(diǎn)
優(yōu)點(diǎn)：
1. 外源基因表達(dá)水平高、易于表達(dá)異源多聚體蛋白、安全性高。
2. 重組表達(dá)的蛋白產(chǎn)品具有正確的翻譯后修飾和生物學(xué)活性，如二硫鍵的形成、磷酸化、糖基化等等。
3. 相對(duì)于哺乳動(dòng)物細(xì)胞蛋白表達(dá)系統(tǒng)，蛋白昆蟲表達(dá)體系所生產(chǎn)的蛋白，糖基化程度偏低。但是昆蟲蛋白表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)勢在于，利用病毒進(jìn)行轉(zhuǎn)染，操作相對(duì)容易，轉(zhuǎn)染體系容易形成（相對(duì)哺乳動(dòng)物瞬時(shí)轉(zhuǎn)染體系）。
4. 可容納大分子的插入片段。
5. 昆蟲細(xì)胞懸浮生長，容易放大培養(yǎng)，有利于大規(guī)模表達(dá)重組蛋白。
6. 易于表達(dá)異源多聚體蛋白，可通過多種重組病毒同時(shí)感染昆蟲細(xì)胞或用含有多個(gè)表達(dá)框的一種病毒感染昆蟲細(xì)胞來實(shí)現(xiàn)
缺點(diǎn)：
外源蛋白表達(dá)處于極晚期病毒啟動(dòng)子的調(diào)控之下，這時(shí)由于病毒感染，細(xì)胞開始死亡。

四、昆蟲表達(dá)系統(tǒng)的應(yīng)用
1．作為超高效的真核基因表達(dá)載體，生產(chǎn)有用的工程蛋白
2．作為基因工程病毒殺蟲劑，提高害蟲防治效率
3．研究桿狀病毒基因組的結(jié)構(gòu)與功能
4．研究真核基因表達(dá)的調(diào)控機(jī)制