上周四，賽業生物細胞工程高級科學家翟曉晨博士為大家帶來了「流式細胞術在CAR-T細胞治療藥物開發中的應用」線上課程，在最后的答疑環節，大家提出了許多困擾已久的問題，就讓云課堂小助理帶大家一起回顧一下這些精彩問答吧！

Q:流式細胞術操作的具體過程？
A:
1. 方案設計：包括確定檢測標志物，依據檢測指標表達特性進行配色；
2. 樣本處理：依據樣本是細胞還是組織樣本確定樣本的處理方法；
3. 染色：依據所用抗體的特性和檢測指標的特性確定染色順序和染色條件；
4. 上機檢測：進行邏輯設門，對檢測指標進行分析。

Q:CAR-T細胞治療方法需要開展哪些方面的評價？
A:在臨床前的研究目標主要是評估CAR-T細胞的有效性和安全性，包括體外藥效評價和體內藥效評價。體外藥效的評價指標主要包括CAR-T細胞殺傷腫瘤細胞活性、細胞因子分泌和CAR-T細胞增殖等。體內藥效主要包括腫瘤生長抑制效果、小鼠生存期延長以及毒副作用評估等。

Q:檢測T細胞耗竭用什么標志物？
A:T細胞凋亡和活化都有相應的指標來指示，活化指標通常用CD25和CD69兩個指標來檢測；耗竭指標包括PD-1、LAG-3、TIM-3和CTLA-4等，其中PD-1是最常檢測的一個指標。

Q:四代釋放免疫檢查點抑制劑的CAR-T細胞，是否可以用流式來檢測？
A:首先CAR分子的陽性率一般就是通過流式法來檢測，檢測目標通常是CAR分子上所帶的標簽，如CAR分子有熒光標簽EGFP就能通過流式檢測EGFP來指示CAR分子的表達。其次分泌的免疫檢查點抑制劑也是可以通過流式法來檢測，但必須滿足一些條件，例如免疫檢查點抑制劑上有一些標簽例如His標簽等，就可以通過透膜流式實驗來檢測；再例如，如果有檢測免疫檢查點抑制劑的抗體也可以通過流式透膜實驗直接對免疫檢查點抑制劑進行檢測。

Q:在細胞因子釋放檢測中，常用哪些方法？
A: 目前檢測細胞因子的方法有很多。我們常用的方案包括Elisa和CBA方案。Elisa法通常只能實現樣本中單因子的檢測，因此對多個因子的檢測就需要更多的樣本量；CBA法可以實現單次多個樣本的檢測，對樣本的需求量比較少。