內毒素-菌體中毒性物質總稱

【名詞解釋】

• 熱原（Pyrogen）：凡是能造成生物機體體溫上升的物質均可稱為熱原。

• 內毒素（Endotoxi）：由革蘭氏陰性菌外層細胞膜在死亡或分裂時產生的物質。主要成分為脂多糖（LSP, LipoPolySaccharide），其單位為Eu/mg或Eu/U）。內毒素是一種熱原，其它可造成體溫升高的熱原還有如：革蘭氏陰性菌的肽葡萄糖（Peptidoglycan），脂磷壁酸質（lipoteichoic），物胞壁酰肽（muramyl  peptides），寄生蟲等。

各種細菌的內毒素的毒性作用較弱，大致相同，可引起發熱、微循環障礙、內毒素休克及播散性血管內凝血等。內毒素耐熱而穩定，抗原性弱。可刺激機體產生抗體，但無中和作用，形成抗毒素，經甲醛處理不能成為類毒素。

內毒素是革蘭氏陰性細菌細胞壁中的一種成分，叫做脂多糖。脂多糖對宿主是有毒性的。雖然內毒素緊密地嵌入細胞壁中，但也會不斷地向周圍環境釋放內毒素，這種釋放不僅僅是因為細胞的解體和死亡造成的，也會發生在正常細胞生長和分裂過程中。

內毒素不是蛋白質，因此非常耐熱。在100℃的高溫下加熱1小時也不會被破壞，只有在160℃的溫度下加熱2到4個小時，或用強堿、強酸或強氧化劑加溫煮沸30分鐘才能破壞它的生物活性。與外毒素不同之處在于：內毒素不能被稀甲醛溶液脫去毒性成為類毒素；把內毒素注射到機體內雖可產生一定量的特異免疫產物（稱為抗體），但這種抗體抵消內毒素毒性的作用微弱。
 

TWO
 

內毒素檢測方法選擇的考量

（檢測原理）

內毒素的檢測方法有哪些？

1. 凝膠法簡便易操作，有可能無法排除干擾作用；若樣品稀釋到MVD仍不能排除干擾作用，應進一步對供試品的前處理進行研究，再用干擾試驗驗證是否能用凝膠法。

2. 光度法包括濁度法和顯色法，可定量檢測內毒素的含量。能較為準確評估產品在生產過程中污染的相對風險，定量檢測的數據不僅有利于追蹤產品質量趨勢，還能起到風險預警的作用，更易達到數據完整性的要求。

3. 凝膠法常用的反應容器為玻璃小試管或安瓿瓶；光度法常用的反應容器為測定儀器專用的試管或酶標板。

鱟試劑凝膠法檢測原理圖示

（圖片來源：https://kepleybiosystems.com/hcrbi,侵刪）

內毒素檢測注意事項

1. 實驗前應復核鱟試劑產品的靈敏度和自身凝集時間，因為鱟試劑本身靈敏度的改變或質量不符合要求，能影響實驗結果。

2. 細菌內毒素工作品效價誤差或不穩定，可影響實驗結果。

3. 嚴格使用廠家配備的細菌內毒素檢測用水。

4. 實驗操作誤差：操作順序和熟練程度尤為重要。一般順序：制備內毒素標準溶液、稀釋樣本、溶解鱟試劑、擺放試管、加樣或加試劑、封口恒溫、觀察結果并記錄。

5. 實驗器具的潔凈度影響：硫酸浸泡4h，蒸餾水沖洗，干熱滅菌。

6. 實驗條件：潔凈、無塵埃空氣流通。

7. 溫度：室溫25±2℃，恒溫水浴溫度為37±1℃。

樣本自身干擾，對含有多糖類藥品或培養基上清，應選用特異性鱟試劑或普通鱟試劑+G因子抑制劑。pH不在檢測范圍內的及時調整。

 

內毒素檢測的影響因素

試驗條件與操作：培養條件、操作環境可能引起各次實驗之間、各實驗室之間的結果差異。

1. 時間：鱟試劑在液態時不穩定，室溫放置太久會影響反應靈敏度，加樣結束后，應立即放入恒溫水浴中，延長保溫時間，可提高LAL的靈敏度。5分鐘混合點的活性最強，混合時間越長，活性反而降低，但在三十分鐘以內的各混合時間點測定的靈敏度均在規定范圍內。在顯色法中靈敏度與時間有關，實驗中既要嚴格控制每個環節的保溫時間，又要嚴格控制終止時間。

2. 溫度：凝膠試驗規定的孵化溫度為37℃，實驗證明，保溫在25-41℃，隨著溫度的升高，LAL的靈敏度也隨著升高，在41-46℃之間，對靈敏度無明顯影響；≥48℃會破壞鱟試劑。

3. pH值：鱟試劑的pH作用區間是6-8之間，7.0-7.5最佳。

4. 試驗耗材：內毒素稀釋不宜用注射器，應使用經過校正的刻度吸管。且針栓膠塞容易吸附內毒素而使其濃度不夠，造成凝膠反應不成立。

5. 操作程序：加樣次序可能會出現實驗結果不成立等問題。

   供試品

6. 多糖：β-葡聚糖可以激活G因子使得結果呈陽性。實驗室常用的酒精、棉球等含有較多的葡聚糖，低于一定濃度的葡聚糖或LAL-RM（反應物）不足以使鱟試劑的凝集反應產生陽性，但如果有細菌內毒素共同作用的情況下，凝集反應會變得更為激烈和迅速，很容易使反應出現陽性結果。

7. 蛋白：

   〖陽離子蛋白〗：溶菌酶、核糖核酸酶A、以及人的免疫球蛋白G能夠與細菌內毒素形成細菌內毒素-蛋白復合體，對細菌內毒素有顯著的屏蔽作用，從而影響用鱟法來測定內毒素。在測定之前使用蛋白酶K來消化樣品，可使細菌內毒素的回收率達到百分之百。

   〖血紅蛋白〗：人血白蛋白、球蛋白、抗凝血酶Ⅲ均可以激活G因子。研究表明使用一般鱟試劑測定人血白蛋白、球蛋白等血液制品的陽性檢出率明顯高于用去G因子LAL測定的陽性率，而后者與兔熱原檢查結果基本一致。

   〖免疫蛋白〗：免疫球蛋白可以激活G因子途徑。

8. 離子：離子強度較大會引起內毒素的聚集，加重低濃度內毒素不易分散的問題；另外LAL中的C因子必須在二價陽離子的參與下才能被激活形成活化的C因子。研究發現鎂離子增強了LAL顯色反應，鈣離子濃度大于5mmol/L時抑制反應。當溶液中含有EDTA等絡合劑或抗凝劑時，陽性離子會失去作用，也就會影響測定。

9. 有機鹽：核酸鈉能像內毒素一樣被檢出，出現假陽性干擾。

10. 透析液：鱟試劑測定透析液中的內毒素方法待進一步考察。

11. 中藥成分：清熱解毒類藥物等能夠干擾LAL試驗。

12. 生化藥品：氨基酸對鱟試劑有較強的抑制作用。

13. 其它物質：多種凝血因子、蛋白質變性物質、高糖溶液、絡合物、電解質、維生素、添加劑等都會干擾鱟試劑形成凝膠。

14. 鱟試劑內源性因子：試劑盒內部因子干擾。

15. 試劑質量：批次、溶解水、靈敏度等。

16. 處理作用：不同產品處理和儲存條件可能為出現分析的誤差，鱟試劑溶解后的保存條件等。

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