慢性腎臟病（Chronic Kidney Disease, CKD）是全球公共衛生問題，并呈進展性、不可逆轉性發展為終末期腎衰竭（End Stage Renal Dysfunction, ESRD）。ESRD的最終歸途為腎纖維化，其顯著的病理特征表現為腎小球硬化、腎小管萎縮和腎小管間質膠原纖維沉積。足細胞（Podocyte），即腎小囊臟層上皮細胞損傷誘導蛋白尿的產生被認為是腎小球硬化的核心事件。但是足細胞損傷的相關調控機制尚不明確。研究表明，足細胞可作為一種非專職的抗原呈遞細胞介導腎小球腎炎的發生。體內外實驗研究表明，病理狀態下足細胞膜表面MHC II類分子表達上調，且共刺激信號分子B7-1的表達水平也出現了顯著增加。

2013年，新英格蘭雜志首次報道B7-1的靶向抑制劑CTLA4-免疫球蛋白融合蛋白（CTLA4-Ig）阿巴西普可以治療原發和復發性局灶節段性腎小球硬化（FSGS）以及微小病變（MCD）患者^[2]。但圍繞著足細胞特異性表達B7-1的檢測及CTLA4-Ig在腎臟病臨床應用爭議不休^[3]。因此，明確足細胞B7-1的特異性表達及作用機制具有十分重要的意義。

2022年6月，南方醫科大學南方醫院腎內科周麗麗教授團隊在Cell Death & Differentiation發表了題為“B7-1 mediates podocyte injury and glomerulosclerosis through communication with Hsp90ab1-LRP5-β-catenin pathway”的最新研究成果。該研究充分證明了腎小球病理狀態下，足細胞共刺激信號分子B7-1表達上調，并發現足細胞B7-1通過Hsp90ab1激活β-catenin信號誘導蛋白尿和腎小損傷的作用機制^[1]。
 

圖片來源：Cell Death & Differentiation

研究材料與方法
在該研究中，研究人員通過RNAscope和免疫熒光共定位等實驗充分證明足細胞損傷誘導B7-1表達上調。為研究足細胞B7-1的致病機制，他們使用了多個小鼠模型，并委托賽業生物構建了足細胞特異性表達B7-1轉基因小鼠（Tg小鼠）。通過轉錄組測序、IP-MS分析、分子對接模擬、分離腎小球微器官培養、腺相關病毒構建基因敲除小鼠等技術手段，發現足細胞B7-1與Hsp90ab1相互作用介導β-catenin信號活化，導致足細胞損傷和腎小球硬化的網絡調節機制。

技術路線
01 腎病患者組織和動物模型中檢測腎小球足細胞B7-1表達水平和足細胞損傷的相關性。
02 構建足細胞特異性過表達B7-1轉基因小鼠，轉錄組測序和實驗分析驗證足細胞B7-1上調表達誘導足細胞損傷及其作用機制。
03 通過體內外阿霉素誘導足細胞損傷模型及B7-1表達干擾實驗，驗證下調B7-1可緩解蛋白尿發生和足細胞損傷。
04 通過IP-MS實驗及分子對接模擬分析發現足細胞B7-1與Hsp90ab1的相互作用，并通過LRP5介學β-catenin活化。
05 通過腺相關病毒AAV原位注射干擾Tg小鼠Hsp90ab1表達，并通過抑制劑或質粒注射干擾阿霉素動物模型，明確B7-1通過Hsp90ab1激活β-catenin信號并介導足細胞損傷的效應。
06 細胞實驗及染色質免疫共沉淀發現β-catenin活化入核促進足細胞B7-1的表達進一步上調。

研究結果
1.足細胞B7-1在多種腎小球疾病中上調并伴有β-catenin信號激活
既往研究中發現腎病患者切片腎小球B7-1蛋白檢測存在重復性差的缺點，為此，研究人員通過RNAscope原位雜交技術檢測腎小球B7-1的mRNA水平，并通過足細胞標志物α-actinin4免疫熒光共定位明確B7-1表達上調定位于足細胞。ELISA實驗檢測新入院腎病患者尿液中可溶性B7-1的表達水平，發現B7-1與腎小球濾過率呈負相關關系，而與尿白蛋白水平呈正相關關系，提示B7-1與足細胞及腎小球損傷密切相關。同時研究人員還對多個腎小球疾病動物模型進行檢測，結果均提示足細胞B7-1表達上調，且腎損傷關鍵調節蛋白β-catenin信號增強。
 

圖1 足細胞B7-1在多種腎小球病理條件下表達上調^[1]

2.B7-1通過激活β-catenin信號通路介導足細胞損傷
為了探究足細胞B7-1如何介導蛋白尿（Proteinuria）的發生及足細胞損傷，研究人員委托賽業公司構建了足細胞特異表達B7-1轉基因小鼠（Tg小鼠）。對自然狀態下多個時間點的Tg小鼠進行取材及研究發現，隨著時間推移，足細胞B7-1表達上調，并伴隨尿蛋白水平增加、腎小球結構改變及足細胞上皮標志物的丟失。通過轉錄組測序及相關驗證發現Tg小鼠腎臟組織β-catenin信號活化。相反，將B7-1基因表達敲低可以抑制β-連環蛋白從而減輕足細胞損傷和腎小球損傷。
 

圖2 足細胞B7-1上調促進蛋白尿和足細胞損傷進展^[1]

3.Hsp90ab1在B7-1向LRP5/β-catenin通路的信號傳遞中起關鍵作用
為了進一步探究足細胞B7-1如何通過β-catenin信號通路介導足細胞損傷，研究人員采用足細胞過表達B7-1并進行IP-MS技術鑒定分析，并通過體內外蛋白質免疫共沉淀及免疫熒光共定位等手段進行驗證，發現B7-1可能通過Hsp90ab1介導β-catenin信號通路。
 

圖3 IP-MS及體內外實驗驗證足細胞B7-1與Hsp90ab1相互作用^[1]

B7-1與Hsp90ab1究竟是如何相互作用，并介導β-catenin活化的呢，研究人員通過分子對接模擬和蛋白定點突變等方法進行驗證，發現位于Hsp90ab1N端的K69位點可能是B7-1的有效結合位點，介導了B7-1的下游效應。同時，通過文獻查閱發現，Hsp90ab1可能通過結合LRP5激活β-catenin,為此研究人員進一步模擬出了三者的結合構象，并對其進行了相關驗證，結果顯示B7-1-Hsp90ab1-LRP5復合體形成可能是介導β-catenin信號通路的重要橋梁。

圖4 分子對接模擬確定B7-1與Hsp90ab1的結合位點，B7-1通過Hsp90ab1及LRP5傳遞信號激活β-catenin信號^[1]

4.Hsp90ab1介導B7-1誘導的足細胞損傷和腎小球損傷

為了進一步明確Hsp90ab1的作用，研究人員通過AAV原位注射實驗干擾Tg小鼠腎臟Hsp90ab1表達水平。結果發現，敲低Hsp90ab1表達可以抑制β-catenin活化，減輕由B7-1誘導的蛋白尿和足細胞損傷。
 

圖5 敲低Hsp90ab1可通過抑制β-catenin信號減輕足細胞B7-1上調誘導的足細胞損傷^[1]

β-catenin信號活化是否對B7-1也有作用呢，研究人員通過染色質免疫共沉淀的方法進行驗證，發現，活化的β-catenin轉位入核介導B7-1的轉錄調控，從而構成正反饋調節環。

圖6 β-catenin介導B7-1的轉錄調控^[1]
 

研究結論

圖7 足細胞B7-1介導β-catenin信號活化誘導足細胞損傷的潛在機制^[1]

綜上所述，該研究綜合了RNAscope、Tg小鼠、轉錄組測序、蛋白質譜測序、分子對接模擬及AAV原位注射等技術手段，充分說明了腎小球損傷誘導足細胞B7-1表達上調，繼而通過B7-1與Hsp90ab1的相互作用介導B7-1-Hsp90ab1-LRP5復合體的形成，促進β-catenin活化發生酪氨酸磷酸化進一步轉位入核繼而引起下游級聯反應。此外，β-catenin入核可以繼續調控B7-1的基因轉錄水平，B7-1與β-catenin通路形成正反饋調節環路從而促進足細胞損傷和腎小球硬化的持續進展。

參考文獻：

[1] Li, J., et al., B7-1 mediates podocyte injury and glomerulosclerosis through communication with Hsp90ab1-LRP5-beta-catenin pathway. Cell Death Differ, 2022.

[2] Yu, C.C., et al., Abatacept in B7-1-positive proteinuric kidney disease. N Engl J Med, 2013. 369(25): p. 2416-23.

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