Nqo1基因敲除小鼠：研究因環境化學物質罹患癌癥風險的有效手段
Nqo1基因是NAD(P)H脫氫酶（醌）家族的成員，該基因的突變與遲發性運動障礙（TD）有關。Nqo1基因催化醌及其衍生物的雙電子還原，包括偶氮染料和硝基芳香族化合物。與正常組織相比，Nqo1在某些腫瘤類型中表達更高，目前已被用于開發生物還原性化療制劑。與Nqo1相關的疾病包括遲發性運動障礙和結腸腺癌。
賽業生物《每周一鼠》，每周五更新，為大家講解一個小鼠模型的故事，希望對大家了解不同的小鼠模型有所幫助。今天和大家見面的是Nqo1基因敲除小鼠。
Nqo1基因簡介
Nqo1基因是一個蛋白質編碼基因，具有種族特異性，人Nqo1位于16q22.1，長為20kb，含6個外顯子和5個內含子，編碼274個氨基酸的黃素蛋白酶，其廣泛分布于絕大多數真核生物細胞胞漿，如上皮細胞、內皮細胞、神經細胞、膠質細胞、乳腺癌細胞等，是抗氧化損傷和保護細胞的主要因子。在各種環境因素（如缺氧、物質依賴等）刺激下可誘導Nqo1表達，Nqo1缺失或失活可引起細胞對應激源敏感性增高。
Nqo1通過催化醌類化合物及衍生物進行雙電子氧化-還原反應，其產物氫醒能在細胞內穩定結合或排泄出來，可防止醌類及氧自由基等因素損傷細胞DNA，進而減低醌類化合物的致癌和致畸性的危害，從而保護細胞免受氧化還原循環和氧化應激的損傷[1-2]。研究發現，應激源可刺激激活Nqo1表達，通過CAMP、鈣通道、ERK1/2、JNK和PI3K/PKB等信號通路發揮相應的病理生理作用。
圖1 Nqo1基因相關信息
來源：RDDC罕見病數據中心
（https://rddc.tsinghua-gd.org/details/gene?gene=WGWKWG）
Nqo1敲除小鼠模型的應用
1.皮膚癌
Nqo1基因能夠保護細胞免受氧化還原循環、氧化應激的影響，同時還能夠降低腫瘤形成的可能性，Nqo1缺失的小鼠可能更容易對代謝為醌類的化學物質發生皮膚腫瘤。據統計，超過2%的人群為Nqo1突變等位基因純合，不表達Nqo1基因。超過20%的人群攜帶一個突變的Nqo1等位基因，并缺乏Nqo1蛋白和活性[3]，存在更高的化學誘導氧化應激和其他相關疾病的風險。為了研究Nqo1在已知致癌物作用下對人皮膚組織的影響，研究人員利用基因編輯技術，建立了Nqo1基因敲除小鼠模型，并分析了野生型和Nqo1敲除小鼠腫瘤生成情況和易感率。
圖2 BPDE誘導Nqo1基因敲除小鼠及野生小鼠皮膚致癌的表型差異[4]
在模型小鼠中，Nqo1基因的破壞導致了由NAD(P)H積累引起的細胞內氧化還原狀態的改變，改變碳水化合物、脂質和核苷酸代謝；引起骨髓中p53和p73水平降低，細胞凋亡減少，進而導致骨髓成髓性增生。同時，對致癌物DMBA和BP的皮膚致癌反應敏感性顯著增加。由于缺乏足夠的p53誘導，Nqo1缺失小鼠對多環芳烴（PAH）致癌的易感性增加。細胞內氧化還原狀態的改變/NAD降低/Nqo1與p53相互作用的缺失，都可能導致p53的快速降解，降低p53對PAHs的應答誘導，增加腫瘤易感性。與野生型小鼠相比，雄性和雌性Nqo1缺失小鼠更容易發生BPDE誘導的皮膚腫瘤，對致癌物的易感性在性別上存在顯著差異。
以上結果表明，Nqo1在催化醌的代謝解毒方面具有重要作用，能夠保護細胞免受氧化還原循環和氧化應激的影響。在Nqo1缺失小鼠中，p53可能被充分誘導響應BP，但由于NAD水平降低而降解，表明Nqo1與p53相互作用可以使p53趨向穩定。
2.致癌物敏感性
Nqo1是一種在真核生物中普遍存在的胞質蛋白。在哺乳動物中，它存在于許多器官當中，但在肝臟中含量最多。然而，在人類基因組中，Nqo1在許多肝外組織中活性更高。Nqo1基因在多種因素作用的誘導下進行表達，包括外源生物、氧化劑、抗氧化劑、紫外光、電離輻射等。為了確定Nqo1在外源因素影響下發揮的作用，研究人員建立了Nqo1基因敲除小鼠模型。
圖3Nqo1基因敲除小鼠模型的建立[5]
在胚胎干細胞中采用同源重組的方法破壞Nqo1基因，在載體結構的3’端插入一個單純皰疹病毒胸苷激酶（HSV-TK）基因，將基因外顯子6替換成帶有Neo的元件序列，以便后續的基因型篩選。野生型Nqo1+/+、雜合型Nqo1+/-、純合型Nqo1-/-小鼠作大體和組織學檢查包括肝、肺、腎、結腸、胃、十二指腸、脾臟、胸腺、淋巴結、心臟、大腦和骨骼肌。結果發現各器官的解剖生理結構未見明顯差異。為檢測致癌物對Nqo1敲除小鼠的影響，研究人員將甲萘醌（維生素K3）溶于二甲亞砜中，按照小鼠體重每日腹腔注射給藥，連續注射3天，每天觀察動物的毒性癥狀和死亡率。與野生型小鼠相比，Nqo1-/-小鼠對甲萘醌毒性的敏感性顯著增加。
圖4 甲萘醌對野生型Nqo1+/+、雜合型Nqo1+/-、純合型Nqo1-/-小鼠毒性的影響[5]
在5、10和20mg甲萘醌/公斤體重的劑量下，野生型和Nqo1-/-小鼠的存活率存在顯著差異。隨后，研究人員將野生型、雜合子和敲除小鼠血清中天門冬氨酸轉氨酶和丙氨酸轉氨酶水平作為肝損傷的指標。這兩種酶都在Nqo1-/-小鼠中均被發現升高，雜合子小鼠對甲萘醌表現出中等敏感性，而對野生型小鼠血清中指標無影響。
以上結果表明，Nqo1-/-小鼠對甲萘醌毒性的敏感性顯著增加。Nqo1-/-小鼠的建立，為確定Nqo1在體內對氧化還原循環激活化合物的保護作用，以及這些小鼠在暴露于環境致癌物時是否對癌癥敏感，提供了非常重要的工具。（賽業可提供同類型Nqo1基因敲除模型，產品編號：S-KO-03389）
總結
與Nqo1基因相關的疾病有多種，包括皮膚癌、阿爾茨海默癥、胃與十二指腸的克羅恩氏病、遲發性運動障礙、兒童白血病縮、乳頭狀甲狀腺微癌、老年性白內障肝細胞腺瘤等。Nqo1是一種可誘導的還原酶，酚類抗氧化劑、多環芳烴、偶氮燃料、缺氧等外界環境因素均可強烈地誘導Nqo1表達，這種可誘導性表達使Nqo1在腫瘤預防和腫瘤治療中起到重要作用。Nqo1基因敲除小鼠可用于皮膚癌等癌癥相關疾病，以及致癌物誘發相關疾病的研究，能夠為這些研究領域提供新思路。
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Nqo1基因敲除小鼠
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品系名稱：
C57BL/6J-Nqo1em1Cya
品系編號：
KOCMP-18104-Nqo1-B6J-VA
產品編號：
S-KO-03389
應用方向：
❖ 皮膚,腫瘤研究
❖ 癌癥、心血管
❖ 胞死亡,內穩態/代謝
打靶方案：
Nqo1基因敲除小鼠打靶方案示意圖
[1]Oppermann Udo,Carbonyl reductases: the complex relationships of mammalian carbonyl- and quinone-reducing enzymes and their role in physiology.[J] .Annu Rev Pharmacol Toxicol, 2007, 47: 293-322.
[2] Salehabadi Amin,Farkhondeh Tahereh,Harifi-Mood Mohammad Sadra et al. Role of Nrf2 in bisphenol effects: a review study.[J] .Environ Sci Pollut Res Int, 2022, 29: 55457-55472.
[3] Rothman N,Smith M T,Hayes R B et al. Benzene poisoning, a risk factor for hematological malignancy, is associated with the NQO1 609C-->T mutation and rapid fractional excretion of chlorzoxazone.[J] .Cancer Res, 1997, 57: 2839-42.
[4] Iskander Karim,Gaikwad Amos,Paquet Marilene et al. Lower induction of p53 and decreased apoptosis in NQO1-null mice lead to increased sensitivity to chemical-induced skin carcinogenesis.[J] .Cancer Res, 2005, 65: 2054-8.
[5]Radjendirane V, Joseph P, Lee YH, Kimura S, Klein-Szanto AJ, Gonzalez FJ, Jaiswal AK. Disruption of the DT diaphorase (NQO1) gene in mice leads to increased menadione toxicity. J Biol Chem. 1998 Mar 27;273(13):7382-9. doi: 10.1074/jbc.273.13.7382. PMID: 9516435.
