原代分離細胞培養是指從供體內取出組織后，經機械以及消化分離成單個細胞或單一型細胞群，使之在體外模擬人體生理環境，在無菌、適當溫度和一定的營養條件下，生存、生長和繁殖。原代培養細胞常有不同的細胞成分，生長緩慢，但是更能代表所來源的組織細胞類型和表達組織的特異性特征。利用原代細胞培養做各種實驗，如藥物測試、細胞分化及病毒學方面的試驗效果很好。其操作步驟如下。

1、凍存細胞：

（1）選對數增生期細胞(證明無支原體污染)，在凍存前1d換液。

（2）按常規方法把培養細胞制備成懸液，計數，使細胞密度達5×10^7／ml左右密度，離心，去上清。

（3）加入配制好的凍存液（培養液6.8ml，小牛血清2ml，DMSO 1ml，5.6%NaHCO3 0.1ml），按與去上清相同的量一滴一滴加入離心管中，然后用吸管輕輕吹打令細胞重懸。凍存細胞時培養液中加入保護劑10％二甲基亞砜(DMSO) 或甘油，可使冰點降低，使細胞內水分在凍結前透出細胞外。

（4）分裝于無菌凍存管中，每管加1.5m懸液。

（5）旋好凍存管并仔細檢查，一定要蓋緊，做好標記。

（6）凍存：在特殊的儀器或簡易的液氮容器中，按-1℃／min的速度，在30～40min時間內，下降到液氮表面，再停30min后，直接投入液氮中。要適當掌握下降冷凍速度，過快能影響細胞內水分透出，太慢則促進冰晶形成。

操作時應戴防護眼鏡和手套，以免液氮凍傷。

2、復蘇細胞：

（1）從罐中取出凍存管。

（2）迅速放入36℃～37℃水浴，不時搖動，使其急速融化，30～60s內完成。

（3）凍存管用70％酒精擦拭消毒后，打開蓋子，用吸管將細胞懸液注入離心管中，再滴加10ml培養液。

（4）低速離心(500～1000r／min) 5min，去上清后再用培養液洗一次。

（5）用培養液適當稀釋后，裝入培養瓶37℃培養，次日更換一次培養液后，繼續培養。以后仍按常規進行培養。

凍存細胞數量要充分，密度應達到107／ml，在融后稀釋20倍時，仍能保持5×105／ml數量。

細胞的凍存和復蘇，讓某些細胞可以保存到現在。