上海交通大學醫學院 課題組長

 

中國“腦計劃”已于2021年底開始實施，成為繼美國的“BRAIN Initiative”，歐洲的“Human Brain Project”和日本的“Brain/MINDS”之后，推動腦科學研究的又一重要舉措。各國“腦計劃”的一個核心目標是——理解大腦的神經活動如何塑造認知和產生行為。

 

     1. 神經元集群     

 

什么樣的神經活動能夠恰當地反映大腦功能？

經典的神經元學說(neuron doctrine)提出單個神經元是大腦的功能單位。然而，單個神經元常表現明顯的活動不穩定性和功能多變性，對相同的外界刺激往往有顯著的差異反應（視頻1），難以成為大腦的功能單位。

由于神經元并非孤立存在，它們可直接或間接地經由物理連接(如突觸)與其它神經元形成多樣的功能結構；于是神經元集群(ensemble)、集合 (assembly)及印記(engram)等相近的功能概念被提出。集群概念與神經環路側重于物理連接不同，更偏重于描述同一腦區內能夠被反復地共同激活的一群神經元^{[1, 2]}。

 

集群有何特征？

構成集群的神經元在空間上可分散分布，也不必具備完全相同的功能偏好^{[3, 4]}，但它們的集體活動模式可編碼大腦對外界刺激(如光帶的朝向和運動)或內在狀態(如對某場景的恐懼記憶)的應答。如今，集群作為大腦的基本功能單位的假說正被接受^{[1, 2]}。本文將以小鼠為模型簡要闡述集群的活動及功能研究。

 

     2.神經元集群研究方法     

 

首先如何找到集群？

目前尚未發現明顯的集群分子標記，說明集群的形成很可能由神經元的互作模式決定^[1]，與譜系及遺傳特征關系不大。因此集群的確定需要同時記錄一大群神經元各自的活動軌跡，這限制了傳統的膜片鉗或微電極記錄方法的使用。

如何高效準確地同時記錄大量神經元的活動？研究人員根據神經元電活動導致的物理化學變化(如膜電位升高、鈣離子內流、基因轉錄及表達等)，開發了不同的手段。

其中，針對大量神經元的電壓變化進行成像是最直接的方法。目前有不少電壓指示劑(染料或蛋白)能夠根據神經元電壓變化而改變熒光信號強度，可用于檢測動作電位及閾下電位^[5]。然而，電壓成像雖擁有近乎完美的時間分辨率，卻常受限于極低的信噪比(圖2)，暫時難以在大腦功能研究中推廣。

圖2. 電壓成像：電壓敏感指示蛋白的熒光變化能夠反映神經元胞體和樹突快速的電壓變化(A)，但信噪比低(B)

(修改自Adam, Nature, 2019)

神經元被激活會導致一系列即刻早期基因(immediate early gene，IEG)，如c-fos、Arc等快速轉錄及表達。通過檢測IEG或者由它們的啟動子所驅動的熒光蛋白的表達，可標記于同一時段內被激活的神經元(圖3)。該方法適用于在全腦范圍高效標記集群^[6]，但局限于較低的時間分辨率(mRNA，約數分鐘; 蛋白，約數小時)，難以準確關聯集群功能及行為。

圖3. 即刻早期基因介導的活性標記：即刻早期基因的快速轉錄及翻譯可用于標記被激活的神經元

(修改自Zelikowsky, J Neurosci, 2014; Tayler, Curr Biol, 2013)

鈣(離子)成像是目前確定集群及研究其活動的主流技術選擇。由于神經元的動作電位發放顯著提高其胞體的游離鈣離子濃度，使用對鈣離子濃度高度敏感的熒光染料或蛋白，即可通過捕捉其熒光變化間接檢測神經元的活動(圖4)。

雖然鈣離子濃度變化慢于電壓變化，致使鈣成像不如電壓成像般有毫秒級別的時間分辨率，但其熒光信號足夠強及穩定，因而被廣泛用于腦內集群的功能研究^[7]。

以上方法各有優劣，本文將就鈣成像進行闡述。

圖4. 鈣成像：根據對鈣離子敏感的染料(A)或指示蛋白(B)的熒光變化(C)，檢測大量神經元的電活動

(修改自 方偉群，Cell Rep, 2017; 及未發表數據)

鈣成像如何幫助記錄集群活動？

首先需要使用特異結合鈣離子的熒光指示劑或蛋白探針標記大量神經元。該目標的實現可通過將具有細胞滲透性的熒光染料(如OGB1等) 注射入腦內(圖4)，或通過病毒介導將鈣指示蛋白(如GCaMP或jRGECO等)表達于腦內神經元(圖4)，或使用編碼GCaMP的轉基因小鼠(如Thy1-GCaMP6f或TIGRE等；圖5)。 

圖5. GCaMP6f轉基因小鼠：轉基因小鼠穩定表達鈣指示蛋白用于鈣成像

(修改自Scott, Neuron, 2018)

 

     3.神經元集群的功能成像、分析和干預     

 

接下來需要解答的是如何實時捕捉神經元的熒光變化?

可通過單光子，雙光子乃至三光子顯微成像系統實現。由于大腦對長波長的光(如紅外光)散射較少，隨著單、雙及三光子系統所采用的激發光波長遞增，它們的成像深度也大體遞增。

因此，普通的單光子系統(如共聚焦顯微鏡)通常適用于對很淺層的腦組織成像，或通過植入光纖對深部腦區和核團成像，但受限于較低的空間分辨率。而相對于單光子成像，雙光子鈣成像具有更深的穿透力，更高的光收集效率和更小的光毒性，成為目前腦內在體鈣成像的主流方法。通過配合GRIN透鏡的使用，雙光子系統可探測深部腦區，提供高時空分辨率的鈣影像（圖6）。三光子系統的成像深度可超過1mm，為直接無創觀測深部皮層的集群帶來很大便利(圖6)，但目前仍未得到廣泛應用^[8]。本文將就雙光子鈣成像進行闡述。

圖6. 大腦深部鈣成像：使用GRIN透鏡的雙光子成像(A)及三光子顯微成像(B)可對深部腦區進行高分辨率鈣成像

(修改自Jennings, Nature, 2019; Hontani, Sci Adv, 2021）

雙光子鈣成像如何用于研究集群功能？
集群的活動反映其功能。但即便小鼠處于黑暗、安靜和熟悉的環境中并保持靜止，其各腦區的神經元仍有非常活躍的自發放電活動，研究者將難以確定該條件下集群的具體功能。

因此，為了準確判定集群功能，應將小鼠置于具體的情境或行為之下，并實時捕捉其大量神經元的活動軌跡。由于集群對刺激、環境和行為的反應存在動態變化，研究者還應較長時間地記錄集群的鈣活動，從中歸納出神經活動的模式，判定集群的功能偏好及特異性等。

以初級視皮層的layer2/3錐體細胞為例，我們發現給予小鼠特定模式的視覺刺激(如特定朝向的移動光柵)，能夠激活相似的一群神經元，而這群神經元對其它朝向的移動光柵反應明顯較弱。因此，這群神經元組成一個偏好該朝向視覺刺激的集群。這個集群在不同時間對不同朝向的活動強度反映了它的功能選擇性，可被定量分析(圖7)。

圖7. 集群功能判定：集群對特定視覺特征的功能偏好及選擇性可被定量分析

(方偉群，未發表數據)

在體雙光子鈣成像結果能夠提示集群功能與認知及行為的相關性，還需再結合集群調控技術(如光遺傳學等)，驗證二者的因果關系。

然而，傳統的光遺傳學調控方式存在明顯缺陷：

1) 常采取面刺激方式，在短時間內無差別地激活或抑制表達光敏蛋白的大量神經元，其強度遠高于生理狀態下的神經活動強度，很可能造成假象；

2) 雖然采用遺傳標記等方法可僅在特定細胞類型中表達光敏蛋白，實現對細胞類型或投射的特異性干預，但對于相鄰的同類型神經元仍無能為力。雙光子光遺傳學解決了這一難題(圖8)，比如通過使用空間光調節器(spatial light modulator, SLM)將一束激光分為若干小光束，而每一小光束僅聚焦于同一集群的特定神經元上，同時激活或抑制它們。

再結合使用定位于胞體的鈣離子探針和光敏蛋白，可進一步減少由于神經突起交錯導致的非特異性刺激。因此，雙光子光遺傳學可實現對任意神經元的光刺激，精準地調控集群^[9]。

圖8. 雙光子同步鈣成像及光遺傳學：雙光子光遺傳學刺激(A)，結合胞體定位的鈣指示蛋白(B)和光敏蛋白(C)，可實現精準鈣成像和活性調控

(修改自Yang, eLife, 2018; Shemesh, Nat Neurosci, 2017; Shemesh, Neuron, 2020）

雙光子技術調控的集群功能是否反映認知及行為？

以初級視皮層的研究為例，研究者可根據雙光子鈣成像的結果，確定編碼特定視覺特征(如光柵的朝向)的集群，再以雙光子光遺傳學技術特異地激活該集群，對小鼠植入假的視覺信號，活化其下游的環路，使小鼠誤認為接受到特定指令而啟動視覺誘發的飲水行為(圖9)^[10]。

在另一例子中，作者采用類似的“全光學”雙光子成像和調控系統，識別及激活海馬體中的位置細胞集群，改變小鼠的空間記憶(圖10)^[11]。此類研究證明了精準地操縱特定集群的活動可改變小鼠的認知及行為。

圖9. 集群與視覺感知：雙光子光遺傳學激活視覺皮層神經元集群(A)，誘發視覺感知及視覺引導行為(B) 

(修改自Marshel, Science, 2019）

 

圖10. 集群與空間記憶：雙光子“全光學”成像及調控系統(A)能夠精準激活海馬體中的位置細胞集群，改變小鼠的空間記憶(B) 

(修改自Zhang, Nat Methods, 2018; Robinson, Cell, 2020）

以上對集群的功能成像、分析和干預是依次分別開展的，并非最理想的選擇。能否做到三個步驟同步進行，即所謂“閉環”操縱集群^[12]？

這要求系統能夠 “在線”實現準確的活性捕捉，快速的功能判定和高效的活性調控。這樣的閉環系統可以迅速反映集群與行為的即時關聯，并及時反饋，調控集群而改變行為，很可能是研究集群功能與行為的最佳方案(圖11)^{[12, 13]}。

在這樣的方案下，研究者可選擇性地激活特定一群神經元，重現或改變原有集群的活動模式，甚至設計構建新的集群，實現模擬、植入乃至矯正認知的目的，有望為正常及疾病大腦的神經機制研究提供獨特視角和工具。

圖11. 雙光子“閉環”系統能夠同步讀寫集群活動，操控動物行為

(修改自Hausser, N Engl J Med, 2021）

 

     4. 神經元集群與神經疾病     

 

由此引出一個新問題，集群變化是否可作為腦疾病的神經病理指標？

由于雙光子系統能夠準確定位集群的構成神經元的空間分布，精準追蹤及改變其活動軌跡，使得集群的結構和功能具備高度可定量性。集群的功能判定是基于特定情境和行為下神經元的集體活動模式，反映了神經元之間的功能互作，提示集群變化或許可作為神經環路功能的內表型(endophenotype)。

確實，集群在腦疾病(如自閉癥，精神分裂等)小鼠模型中產生明顯變化^{[4, 14]}，與采用其它腦功能檢測技術(如fMRI，微電極陣列等)得到的結論吻合。但是，目前對腦疾病模型中集群的研究仍處于特征描述階段，未能有效調控集群，重現或逆轉疾病癥狀。因此，集群變化是否可作為腦疾病的重要貢獻因素，其充分性和必要性都尚未得到深入探究。

為了更好揭示集群與認知和行為的關系，有必要闡明集群的運行和演進機制。我們需要了解集群的結構及功能如何形成與發展，存在何種可塑性和關鍵期，有何獨特的細胞互作機制，同一腦區功能相關的集群如何競爭(competition)、互補(complementation)、分離 (separation)和整合(integration)，以及不同腦區的上下游集群如何溝通信息。

通過對集群機制的研究，我們有望驗證：操控集群功能是否可以重現或逆轉疾病的核心表型。這些問題也是本課題組的研究興趣所在。我們有理由相信，基于集群成像的高時空分辨率及光調控的精準性，對集群的深入研究將有助于在介觀層面解析神經環路的功能與可塑性，助力對大腦運行規律的解碼，使人類更懂得人類。

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