自2019年12月首次發現以來，新冠肺炎（COVID-19）目前已造成全球5.8億人感染，超過600萬人死亡。盡管疫苗和藥物在不斷上市，但Delta和Omicron等多個變異株的出現給疾病的預防和治療帶來了相當大的挑戰，因此迫切需要更多且有效的預防和治療策略。

廣譜性中和抗體的開發是一種有希望應對目前新冠大流行的策略之一。近年來，來自駱駝等動物的單域抗體受到了廣泛關注。單域抗體指僅含有重鏈可變區的抗體片段，其分子量（15kD）遠遠小于人類抗體（150kD），通常被稱為納米抗體。該抗體不僅具有親和力高、熱穩定性好、生產成本低等特點，還能與傳統抗體無法接觸的表位結合。

近日，廣州醫科大學呼吸疾病國家重點實驗室、廣州實驗室、中科院廣州生物醫藥與健康研究院、廈門聯合呼吸健康研究院等多個機構的研究人員在Small Methods雜志上發表了題為“A Class of Shark-Derived Single-Domain Antibodies can Broadly Neutralize SARS-Related Coronaviruses and the Structural Basis of Neutralization and Omicron Escape”的研究論文。研究人員從鯊魚中篩選出一種單域抗體，能夠有效中和新冠病毒的多個變異株，為預防和治療COVID-19提供了新的選擇。

研究材料和方法
研究主要使用了鯊魚、293T、VeroE6細胞，C57BL/6背景的hACE2轉基因小鼠（由賽業生物提供）、Balb/c小鼠等。

研究人員主要使用了細胞轉染、噬菌體文庫構建、ELISA、WB等實驗技術。

技術路線

01通過免疫鯊魚篩選出抗新冠病毒的納米抗體

02ELISA評估納米抗體中和SARS-CoV-2變異株的能力

03分析納米抗體在hACE2小鼠的預防和保護作用

04晶體結構解析納米抗體與病毒的結合位點

05探索Omicron變異株免疫逃逸的機制

研究結果
01 20G6和17F6納米抗體可廣泛中和SARS-CoV-2變異株
之前的研究發現，來自駱駝的單域抗體能夠與SARS-CoV-2刺突蛋白的受體結合區域（Receptor Binding Domain, RBD）結合。鯊魚的免疫系統也會產生一種單域抗體，即可變的新抗原受體（Variable New Antigen Receptor, VNAR），大小相當于人類抗體的十分之一。于是，研究人員以人工飼養的條紋斑竹鯊作為研究對象，用SARS-CoV-2刺突蛋白對鯊魚進行免疫接種，并構建了噬菌體展示文庫。

經過三輪生物淘選，他們獲得了26個與武漢病毒株的RBD區域特異結合的納米抗體。其中，納米抗體20G6和17F6的RBD結合活性最高。后續分析表明，這兩種納米抗體還能與SARS-CoV-2的Alpha、Beta、Kappa、Delta等變異株的RBD結合，親和力在皮摩爾級別。因此，20G6和17F6對多個值得關注變異株的RBD具有廣泛的反應性。

之后，研究人員利用假病毒中和測定法來評估20G6和17F6對SARS-CoV-2武漢毒株及多個變異株的中和能力，發現20G6和17F6單體和二聚體都可以中和SARS-CoV-2變異株，其半數最大抑制濃度在納摩爾范圍。病灶減少中和實驗的結果也表明，單價和二價形式的20G6和17F6納米抗體可以中和SARS-CoV-2變異株。

02 20G6納米抗體對接種新冠病毒的小鼠具有預防和治療作用
研究人員接著評估納米抗體在新冠病毒感染hACE2小鼠過程中是否具有預防和治療作用。他們在小鼠的鼻腔內滴入20G6納米抗體，然后用武漢毒株或Beta變異株感染小鼠。與對照組相比，預防組小鼠體內病毒基因組RNA拷貝數下降。另外，他們用武漢毒株或Beta變異株感染小鼠后，通過腹膜注射或鼻內滴注的方式給予20G6-Fc，發現治療組小鼠體內病毒基因組RNA的拷貝數也下降（圖1），此外，預防組和治療組小鼠體重均未顯著下降，而且肺病理學特征顯著減少。這些結果表明，20G6納米抗體能夠在預防和治療模型中有效保護小鼠免受SARS-CoV-2武漢毒株和Beta變異株感染。
 

圖1 20G6納米抗體對SARS-CoV-2感染的預防和治療效果

03 納米抗體通過WXGY基序與RBD結合
為了探索這兩種納米抗體有效中和病毒的結合位點，研究人員從結構生物學的角度繼續開展研究。他們發現，20G6和17F6在CDR3中都包含一個獨特的“WXGY基序”，作為納米抗體與RBD相互作用的中心（圖2）。這個基序通過β-折疊與RBD上的隱藏表位（365-380）結合，而該表位在β-冠狀病毒中是高度保守的，表明這兩種抗體具有廣泛的中和活性。

有趣的是，他們發現20G6和17F6納米抗體能夠有效中和穿山甲冠狀病毒和蝙蝠冠狀病毒，卻不能中和Omicron和SARS-CoV-1病毒，那么Omicron變異株如何實現免疫逃逸？他們通過突變分析發現，Omicron RBD上的S375F突變可破壞RBD的β-鏈結構，從而削弱抗體與抗原的相互作用，使得Omicron變異株和SARS-CoV-1逃逸納米抗體中和。
 

圖2 20G6納米抗體結合并中和β-冠狀病毒的能力

研究結論
本研究從鯊魚體內篩選出兩個納米抗體，通過鼻腔給藥可預防大多數SARS-CoV-2變異株的感染。納米抗體通過WXGY基序與RBD結合，具有廣譜結合能力，但Omicron變異株除外，S375F突變是Omicron變異株逃逸抗體中和的主要突變點。該研究為新冠病毒逃逸機制的研究及疫苗抗體的開發提供思路。

原文檢索：
Feng B, Chen Z, Sun J, et al. A Class of Shark-Derived Single-Domain Antibodies can Broadly Neutralize SARS-Related Coronaviruses and the Structural Basis of Neutralization and Omicron Escape. Small Methods. 2022 Jul;6(7):e2200387. doi: 10.1002/smtd.202200387.