​復(fù)水（有時候也用到脫水，只是順序相反）

溫度：環(huán)境

描述：通過一系列的緩沖液交換將樣品從在100% 甲醇或乙醇的儲存條件中轉(zhuǎn)移到水緩沖液中。通常從100%的乙醇交換到75%、50%、25%、0%，每次交換后留5 min進(jìn)行平衡即可。如脫水進(jìn)行太快或不進(jìn)行脫水，樣品形態(tài)將被破壞，甚至被撕成碎片。

漂白（可選）

溫度：環(huán)境

描述：通常與3%的過氧化氫孵育，以擺脫內(nèi)部的過氧化物酶和漂白暗色的胚胎

烷基化（可選，INTAVIS儀器不能完成）

溫度：環(huán)境

描述：三乙醇胺中的乙酸酐用于使組織帶負(fù)電荷，從而降低背景。它被廣泛應(yīng)用，特別是在植物領(lǐng)域，用極少的探針就可以增強(qiáng)結(jié)果。

自動化時：乙酸酐在溶液中非常不穩(wěn)定，它在制備后能用于孵育的時間不超過一分鐘，因此不可能實現(xiàn)自動化（并且探針通常不需要）。

細(xì)胞壁消化（可選，只在植物中）

溫度：環(huán)境

描述：植物樣品中主要使用鹽酸水解細(xì)胞壁。或者如崩潰酶和纖維素酶等酶類也能被使用。

滲透（時間要求嚴(yán)格）

溫度：環(huán)境或37℃

描述：使探針能接觸樣品組織至關(guān)重要。這步處理通常使用蛋白酶，主要是蛋白酶K，但鏈霉蛋白酶和其他蛋白酶也能被使用。但也有其他的處理方法，如熱處理（蒸汽）或與洗滌劑混合物孵育。對于蛋白酶K，甘氨酸通常被用來立即停止蛋白酶K的作用，或者通過數(shù)次換液將蛋白酶K 洗掉。滲透后，通常會使用多聚甲醛進(jìn)行固定。

自動化時：所有蛋白酶應(yīng)足夠穩(wěn)定，到使用前不會自我分解，如蛋白酶K。

雜交

溫度：通常50-70℃（RNAse 在37℃）

描述：雜交由幾步組成：

1，預(yù)雜交步驟（可選）逐步交換雜交 緩沖液，并封閉非特異結(jié)合位點(diǎn)

2，雜交步驟，與探針孵育

3，雜交后洗滌步驟，用越來越嚴(yán)格的緩沖液進(jìn)行多次洗滌

4，通常在雜交后洗脫步驟之間，進(jìn)行RNAse消化（可選）來擺脫未結(jié)合的探針減少背景：RNAse緩沖液洗滌，用RNAse處理，再次RNAse緩沖液洗滌，所有步驟在37℃進(jìn)行。

5，更多的雜交后洗滌

抗體孵育

溫度：環(huán)境或更低

描述：

在此步驟中，抗體與探針上的抗原結(jié)合

1. 用封閉試劑封閉（如Roche 封閉試劑，BSA，山羊或綿羊血清）。在這一步，所有非特異抗體結(jié)合位點(diǎn)將被蛋白飽和

2， 與抗體孵育，讓抗體抗原結(jié)合

3， 洗滌步驟，洗滌未結(jié)合抗體

自動化時：由于基本上所有檢測探針的抗體都是商業(yè)化的，它們室溫下工作并具有相同的特異性。抗體結(jié)合在室溫下更快結(jié)合。

與堿性磷酸酶緩沖液孵育（如NTMT）

溫度：環(huán)境

描述：與新鮮制備的緩沖液孵育，為堿性磷酸酶顏色反應(yīng)做準(zhǔn)備

自動化時：使用堿性磷酸酶偶聯(lián)抗體時，緩沖液儲存過久或使用前制備時會沉淀。