一、相關背景
基因治療是指用正常的基因導入人體細胞，以糾正或補充基因缺陷和異常所引起的疾病，是一種治療遺傳病的根本性策略。歷經30年的艱難發展，基因治療已成為治療人類各種遺傳性疾病的關鍵手段。腺相關病毒（AAV）因其能夠感染廣泛的組織且具有較低的免疫原性和較低的整合能力，被認為具有較好的安全性，因而AAV成為在體基因治療領域最前沿、最有潛力和最常用的病毒載體之一。世界衛生組織發布的《世界視力報告》指出，在全球范圍內，至少有22億人患有視力障礙或失明，至少有10億人是可以預防和治療的。

眼睛由于體積小，較小劑量的AAV載體即可實現穩健轉導，由于血視網膜屏障的存在，相對封閉，具備免疫赦免特性，局部給藥安全性相對較高，且眼底疾病多為單基因遺傳疾病，因此眼部成為基因治療中非常熱門的器官。

目前眼科基因治療的適應癥主要是與單個基因突變相關的遺傳性視網膜疾病（Inherited Retinal Diseases, IRDs），包括視網膜色素變性、無脈絡膜癥、Leber遺傳性視神經病變（LHON）、Leber先天性黑蒙（LCA）、Stargardt病、色盲癥（ACHM）、X連鎖視網膜劈裂癥（XLRS）和年齡相關性黃斑變性（AMD）等，這些患者的獨立生活和日常活動能力受到極大損害，具有極大的醫療需求。因而針對眼部的基因治療研究一直處于基因治療研究的前沿，是AAV基因治療的黃金賽道，占據AAV基因治療臨床試驗四分之一。

圖1 導致視網膜疾病的相關基因^[2]

二、血清型選擇和注射方式
目前已開展的眼科AAV基因治療臨床試驗中靶向眼底的各種細胞類型有很多，如視網膜色素上皮(RPE)、神經節細胞層和感光細胞層。試驗使用的載體以AAV2、5、8血清型居多，但近幾年使用較多的改造載體如AAV2-7M8、AAV2-tYF、scAAV等，已被用于臨床研究。

根據治療目的不同，AAV載體介導的眼部基因轉導途徑主要有玻璃體腔注射、視網膜下腔注射、前房注射、結膜下注射等，其中比較常用的是玻璃體腔注射和視網膜下腔注射。在多種動物模型中，研究表明AAV載體玻璃體腔注射主要感染神經節細胞，此種注射方法會產生針對AAV衣殼蛋白的體液免疫反應，引起眼內炎癥。視網膜下注射主要感染視網膜色素上皮細胞和光感受器細胞，不會觸發體液免疫反應，但要注意避免注射造成的出血損傷以及潛在的視網膜脫離的風險。

三、示例展示
本文中將對眼部常用注射方法予以詳細介紹，供大家在注射方法選擇及操作時參考。

1.前房注射
前房是角膜和虹膜之間的腔隙，為房水所充盈。小鼠巨大的晶狀體向前房隆起，小鼠的前房相對比人體的要淺得多。小鼠前房注射液體或氣體可以提高眼內壓，是制作青光眼模型的方法之一。具體操作步驟如下：

▶ 實驗前準備
麻醉小鼠：在小鼠稱重后，經腹腔注射適量的1%戊巴比妥鈉溶液，放置于飼養籠內，等待麻醉約5-10min。小鼠麻倒后，眼球表面滴入擴瞳劑使其散瞳。

▶ 前房注射
用微量注射器吸取適量病毒備用，取麻醉后的小鼠置于操作臺上，眼部給予鹽酸利多卡因進行局部麻醉，左手按住頭部，使其眼球部分突出，右手持微量注射器從虹膜上1-2mm處插入前房，針尖平行進入，隨后快速推注病毒，形成空氣，使氣泡正好在針頭上，堵住針口，防止漏液。病毒注射完畢，緩慢抽出針頭。

▶ 動物復蘇
將小鼠放回飼養籠內，注意保溫，待其蘇醒。

2.玻璃體腔注射
▶ 實驗前準備
麻醉小鼠：在小鼠稱重后，經腹腔注射適量的1%戊巴比妥鈉溶液，放置于飼養籠內，等待麻醉約5-10min。小鼠麻倒后，眼球表面滴入擴瞳劑使其散瞳。

▶ 玻璃體腔注射
用微量注射器吸取適量病毒備用，取麻醉后的小鼠置于操作臺上，眼部給予鹽酸利多卡因進行局部麻醉，左手按住頭部，使其眼球部分突出，右手持微量注射器自角膜后緣1mm位置插入玻璃體腔內，針尖先垂直進入，隨后傾斜，慢慢推注病毒。病毒注射完畢，緩慢抽出針頭。

▶ 動物復蘇
將小鼠放回飼養籠內，注意保溫，待其蘇醒。

圖3 玻璃體注射

3.視網膜下注射
小鼠的后半眼球壁由內向外分為視網膜、脈絡膜和鞏膜。小鼠視網膜結構與人體類似（圖4），注射具體操作步驟如下：
 

圖4 C57BL小鼠視網膜組織HE染色圖（400×）
 

▶ 實驗前準備
麻醉小鼠：在小鼠稱重后，經腹腔注射適量的1%戊巴比妥鈉溶液，放置于飼養籠內，等待麻醉約5-10min。小鼠麻倒后，眼球表面滴入擴瞳劑使其散瞳。

▶ 病毒注射
用微量注射器吸取適量病毒備用，取麻醉后的小鼠置于操作臺上，眼部給予鹽酸利多卡因進行局部麻醉，左手按住頭部，使其眼球部分突出，右手持微量注射器自角膜后緣1mm位置插入玻璃體腔，針尖先垂直進入，隨后傾斜，直至對側視網膜（經玻璃體腔注射），有阻力時停止進針，慢慢推注病毒。或者用注射器針頭與眼軸呈15°角在動物暴露出的距角膜緣1-2mm處鞏膜開一個扎破鞏膜但不穿透RPE的通道，針頭斜面沒入即停止進針（經鞏膜注射），慢慢推注病毒。病毒注射完畢，緩慢抽出針頭。

▶ 動物復蘇
將小鼠放回飼養籠內，注意保溫，待其蘇醒。

4.結膜下注射
結膜下注射是眼局部給藥的常用方法。具體操作步驟如下

▶ 實驗前準備
麻醉小鼠，等待約5-10min，滴入擴瞳劑。

▶ 病毒注射
用微量注射器吸取適量病毒備用，取麻醉后的小鼠置于操作臺上，眼部給予鹽酸利多卡因進行局部麻醉，用鑷子夾起結膜，沿結膜內側刺入3-4mm，可透過結膜觀察到針頭的走向，慢慢注射病毒，注射完畢，停留數秒拔針，注射后可見球結膜下有隆起，眼球突出。

▶ 動物復蘇
將小鼠放回飼養籠內，注意保溫，待其蘇醒。
 

圖6 結膜下注射

參考文獻：
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