雙十一剛過，肯定有不少小伙伴剁手了吧。雙十一不只是電商的購物狂歡節，還是令人心痛的單身日。小編作為單身狗著實羨慕那甜美的愛情。所以我只能化悲憤為力量全身心的投入到工作中去。作為儀器工作者本以為顯微鏡就是我最好的伙伴，后來發現我還是太年輕了，在這個講究CP感的時代里，我著實被寬場顯微鏡里最甜的CP秀了滿滿一臉。

作為報復的手段，我要把他們的故事講給大家聽，寬場顯微鏡最甜CP-景深擴展與反卷積，接下來我就好好扒一扒它們的前世今生。

首先有請我們的男主角閃亮登場。景深擴展又稱Z-Stacking，在說他的故事前，我們需要明白什么是景深。當鏡頭對著處于焦面物體拍攝時，被拍攝物體與其前后的景物有一段清晰的范圍，這個范圍我們將其稱為“景深”。為了讓大家更好的理解，我在這里給大家舉個例子。
 

圖源：網絡，侵刪

就像圖中一樣，我們在觀察與拍照過程中，有時僅可以看清楚花瓣，有時花瓣根莖葉都可以看清楚，這就是因為景深大小不同所致，大景深看清的物體多如左圖，小景深看清的物體少如右圖，那為什會產生這樣的區別呢？

一個鏡頭只有一個焦平面。處于焦平面上的物體經過物鏡會在目鏡或相機芯片上形成一個點，非焦平面上的點會形成一個模糊圓，這個圓術語叫做彌散圓（circle of confusion），怎么去理解這段話呢？
 

如圖所示，黑色線條為焦平面，焦平面上的點經過物鏡，在相機芯片或視網膜上形成一個小圓點，兩條綠色的線分別是非焦平面，非焦平面點經過目鏡會形成一個圓圈，這個圓圈就是彌散圓（circle of confusion）。如果我們遠離這張圖片，那會發生什么呢？我們中間的這個小點就看不到了，上下的兩個圓斑會越來越小，一直小到和這個點一樣大的時候，我們這時候就認為它不是斑，而是點了。如果彌散圓小到人眼或芯片無法鑒別看起來就是一個點，那這個彌散圓稱為容許彌散圓，可產生容許彌散圓的平面之間的距離稱為景深。

我們再簡單一點，顯微鏡的景深就是當前鏡頭，可以看清楚樣品的厚度。對于觀察者來說，同視野下能看清楚樣品的厚度越厚越好，越厚就證明鏡頭的景深越大。在顯微觀察中是否可以無限制追求大景深呢？答案是否定的。因為景深與物鏡的NA值負相關，而NA值與物鏡的分辨率及放大倍數正相關。關系如下圖所示：

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如何在高倍鏡下獲得大景深的圖像呢？這就輪到我們的男主出場了—景深擴展。

在寬場顯微鏡中，增大顯微圖像景深的通常做法是對樣品進行不同厚度位置的掃描，并采集程序列圖像，以一定的規則進行融合，通過計算重建一幅大景深圖像。
 

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目前顯微鏡實現景深擴展的基礎是什么？

硬件基礎：顯微鏡景深擴展分為手動景深擴展與自動景深擴展。對應的硬件基礎分別為手動準焦螺旋（手動Z軸）與電動準焦螺旋（電動Z軸）。

軟件基礎：Z軸控制與圖像處理。

如果想把我們男主角的魅力發揮到極致，電動Z軸必不可少。因為與手動景深擴展相比電動的優勢有：1、一致性更高 2、步進精度更高 3、可重復性更好 4、操作更為簡便。

從上文的介紹中大家明白了景深擴展優化了顯微鏡在豎直方向的成像效果，那與他在一起的反卷積的功能也就呼之欲出了：優化寬場顯微鏡水平方向的成像效果。

接下來有請我們的女主角登場，同樣的，在講她的故事之前，我們要明白寬場顯微鏡存在分辨率的極限。

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從分辨率的公式中可以看出分辨率與NA值正相關。還記得上文中提到的景深與其負相關嗎？所以說從家庭背景的角度上景深擴展與反卷積就開始彼此糾纏了。書歸正文，通過分辨率公式我們可以得出分辨率的極限是200nm，為了紀念公式的提出者—德國的光學物理學家恩斯特阿貝，人們把這個極限值稱為阿貝極限。人們為了突破分辨率極限誕生了以共聚焦顯微鏡為代表的超高分辨率顯微鏡。它們通過改變照明結構來突破寬場顯微鏡的分辨率極限，以獲取更加清晰的觀察結果。

今天我們討論的是寬場顯微中的最甜CP，共聚焦顯微鏡改變了光路結構不在今天的討論范圍內。那除了硬件改變來提高分辨率，可不可以不改變寬場顯微鏡的光路結構，通過軟件來實現分辨率的突破呢？答案是有的，那就是我們的女主角反卷積。
 

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我們先看上面的圖，如圖所示理想的鏡頭成像時，一個對焦平面上的物點會投影為一個像點，但事實上理想的鏡頭是不存在的，鏡頭總是存在一些缺陷會導致一個物點會投影為很多點，一個點經過鏡頭后成的像由點擴散函數PSF(Point Spread Function)來描述。是不是聽起來有些懵？簡單給大家做個比喻，有美女或帥哥站在你的面前，理論上你可以清楚地看到他的容貌，但實際過程中你和美女帥哥之間多了一塊毛玻璃，這塊毛玻璃就是擴散函數，那能不能把這塊毛玻璃打碎呢？可以的，這就需要用我們的女主角反卷積了。

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如圖所示，我們會有一個很自然的想法就是，如果我們有實際鏡頭的成像，另外還知道了鏡頭的PSF，即我們知道了上式的b和c，是否可以得到更加理想的成像x呢？這個過程稱為去卷積Deconvolution。

經過上面的介紹，相信大家就會明白為什么我會把景深擴展與反卷積稱為寬場顯微鏡最甜CP了吧。男主角景深擴展充滿活力地在Z軸方向上下翻飛，優化顯微鏡豎直方向的成像效果。女主角反卷積穩重包容在水平方向突破自我。這里我還要提一點特別重要的，很多小伙伴認為反卷積作為一種算法沒有硬件的改變是不是隨意搭配任何機型都可以實現。其實不然，每一個公司的每一個型號上的每一顆物鏡都只有唯一的反卷積公式。

最后總結一下，想必大家應該明白我為什么去寫這篇文章了。在顯微觀察過程中存在很多不同的功能，我選擇跟成像質量最相關的功能拿出來跟大家說一下，就是希望小伙伴們在學習與工作中更好的去使用顯微鏡。

口說無憑眼見為真嘛，大家可以用自己實驗室的顯微鏡試一下這對CP的魅力，這兩個功能雖然在市面上很常見，但是能集二者與一身的顯微鏡并不多，怎么解決呢？歡迎大家來試用我們的ECHO顯微鏡吧。
 

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