腎臟芯片或腎臟微流控技術的最新進展顯示，通過概括體內組織特征，在腎臟疾病建模和藥物誘導性腎損傷 (DIKI) 評估方面具有巨大的潛力。三維 (3D) 腎臟模型，從微流體裝置到生物打印近端小管，在流動下培養腎細胞并與細胞外基質 (ECM) 結合，推進體外建模。這種模型也引起了人們的興趣，用于臨床前藥物安全性評估，以改進藥物開發早期階段的 DIKI 預測。

盡管 DIKI 已被描述為腎單位的所有部分，但藥物主要影響近端小管上皮細胞 (PTECs)，因為該段細胞中存在的膜轉運蛋白主動分泌許多外源性物質，這增加了細胞的暴露。大多數腎臟藥物轉運蛋白研究是在傳統的二維靜態細胞培養中進行的，盡管最近這也在 3D 腎臟模型中得到了解決。

流體剪切應力 (FSS) 已被證明對于改善3D 腎臟模型中的體外生物活性和細胞形態很重要。PTECs 在頂端暴露于脈動流中，脈動流是由心臟的泵血作用和腎內血流動力學控制產生，導致腎小球濾過，從而引起 FSS ，這會影響腎細胞的細胞骨架組織。此外，已證明 FSS 刺激了 PTECs 的極化，并在體內發現將其轉化為柱狀形態。將 PTECs 暴露于 FSS 導致白蛋白攝取和 P-gp 活性增加，以及通過OCT2 和 MATE1 的協同作用介導的有機陽離子跨細胞轉運增加。

PTECs向更接近體內形態的這種轉變歸因于FSS, FSS被微絨毛、糖萼和存在于頂端膜的初級纖毛感知。在流動下培養時，初級集合管細胞和腎臟類器官中的初級纖毛數量增多。

去年，來自荷蘭拉德堡德大學藥理學和毒理學系、人類遺傳學系，德國弗萊堡大學醫學院兒科和青少年醫學中心等單位的專家對此領域進行了合作研究，于 Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects 發表了題為《Flow stimulates drug transport in a human kidney proximal tubule-on-a-chip independent of primary cilia》的研究成果。

這項研究旨在闡明 FSS 在人類條件永生化PTEC親本 (ciPTEC-parent) 中藥物轉運活性、白蛋白攝取和上皮細胞形態方面的作用，并將其與微流控3 D裝置 （OrganoPlate）中初級纖毛敲除的ciPTEC系進行比較，評估這是否通過初級纖毛介導的信號傳導。

實驗方法：

ciPTEC-parent在OrganoPlate 中培養，然后施加生理峰值為 2.0 dyne/cm² 或低峰值為 0.5 dyne/cm² 的 FSS。在 FSS 暴露 9 天后，測定白蛋白- FITC 攝取、p -糖蛋白 (P-gp) 和多藥耐藥相關蛋白2/4 (MRP2/4) 的活性、細胞毒性和細胞形態。
 

圖 1

實驗結果：

流體剪切應力誘導白蛋白攝取和 P-gp 活性增加

首先，在正常或低流量培養的ciPTEC-parent 中評估MRP2/4和P-gp的白蛋白攝取和外排活性（圖2 A）。用白蛋白-FITCC測定cubilin- 和 megalin- 介導的白蛋白攝取（圖2 A），在正常流量下與BSA(10 mg/mL)共孵育時，cubilin- 和 megalin- 介導的白蛋白攝取降低了0.65 ± 0.04倍 (圖2B) 。當 ciPTEC-parent在正常流量下培養時 ，與低流量（圖2 B）相比，白蛋白攝取增加，與BSA共孵育時，白蛋白攝取消失 (圖2B)。

P-gp活性的測定采用基于鈣黃綠素-AM的類似的方法，它可以在細胞內自由擴散，是P-gp的底物。與 CsA（30 μM）（一種已知的 P-gp 抑制劑）共同孵育后，與正常和低流量條件相比，鈣黃綠素的積累分別增加了 3.8 ± 0.4 倍和 2.9 ± 0.7 倍（圖2 D)。同樣，與正常和低流量條件相比，暴露于 P-gp 模型抑制劑 PSC833 (5 μM) 后，觀察到鈣黃綠素的積累分別增加了 2.9 ± 0.3 倍和 2.6 ± 0.5 倍（圖 2 D)。與低流量相比，在正常流量下和與PSC833共孵育時，鈣黃綠素-AM 流出顯著增強，表明在正常流量下，在ciPTEC-parent 中P-gp活性增強（圖2 D）。然而，這種增加的外排在暴露于 CsA 時并不顯著。
 

圖 2

MRP2/4 和 P-gp 的白蛋白攝取和轉運活性在初級纖毛敲除模型中不受影響

接下來，實驗研究了正常血流中增加的白蛋白攝取和 P-gp 活性是否可以通過初級纖毛介導的對 FSS 的反應來解釋。因此，在正常和低流量培養時，測量了cubilin- 和megalin-介導的白蛋白攝取以及外排轉運蛋白MRP2/4和P-gp的活性 (圖3 A)。

在正常流量下，白蛋白-FITC 攝取（0.74 ± 0.04 倍）在與 BSA 共孵育后降低（圖3 B）。與 ciPTEC-parent一致， 與低流量（圖3 B）相比，對照組在正常流量下觀察到白蛋白-FITC 攝取顯著增加，但與BSA共孵育時沒有。

MRP2 / 4活性在暴露于PSC833，MK571和Ko143后受到抑制，與正常和低流量對照，GS-MF積累分別增加3.0 ± 0.3倍和2.4 ± 0.6倍（圖3 C ）。與 ciPTEC-parent 相似，GS-MF在正常流動中比在低流動中明顯增加 (圖3 C)，但在對照組和抑制組沒有顯著差異。

在與 CsA 或 PSC833 孵育后，鈣黃綠素的積累量分別比正常流量下增加3.5 ± 0.3倍和3.4 ± 0.4倍（圖3 D）。此外，在低流量條件下，與 CsA 或 PSC833 孵育后，與對照組相比，鈣黃綠素的保留量分別增加了 2.8 ± 1.0 倍和 2.2 ± 0.7 倍（圖3 D）。 
 

圖 3

FSS 誘導的 PTEC 細胞形態變化

在ciPTEC-parent 和ciPTEC-KIF3α−/−中的鈣黃綠素染色的單細胞膜中測量細胞表面積、縱橫比和圓形度。在流動條件和細胞系中觀察到不同的細胞密度。在正常流動條件下，在 ciPTEC-parent 和ciPTEC-KIF3α−/−中培養時，細胞表面積均減少。此外，在正常流動條件下，細胞伸長與軸流方向一致，這與兩種細胞系的更高的縱橫比和ciPTEC-parent細胞的圓度降低有關。

對環孢霉素A （CsA）的細胞毒性反應與正常流量下 P-gp 活性的增強無關

CsA是一種已知的腎毒性物質，據報道可引起內質網(ER)和線粒體的損傷，并增加PTECs的氧化應激。由于 P-gp 活性較低，CsA 誘導的細胞毒性在低流量下可能更嚴重，因此，實驗在24 h的流動條件和細胞系中研究了CsA (30 μM) 的細胞毒性反應（圖 4）。

在 ciPTEC-parent 中（圖4 A），在正常 (94 ± 1%) 和低流量 (95 ± 1%) 條件下暴露于 CsA 后，細胞活力降低。盡管在ciPTEC-parent 中發現P-gp活性在低流量時降低，但這并不導致CsA 誘導的細胞毒性增加（圖4 A）。有趣的是，與 ciPTEC-parent 相比，ciPTEC-KIF3α -/-對 CsA 誘導的細胞毒性更敏感，無論流量如何（圖4 B)，當暴露于正常或低流量（均為71 ± 4%）時，導致細胞活力降低。這表明初級纖毛的相關機制，不是由流動觸發的，而是涉及更敏感的 ciPTEC-KIF3α -/- 表型。
 

圖 4
 

實驗結論：

該研究首次證明 FSS 誘導的 PTEC 白蛋白攝取增加、藥物外排和表型延長與初級纖毛無關。實驗在 OrganoPlate觀察到，在生理相關的脈動 FSS 下培養永生化 PTECs 時，白蛋白攝取、P-gp 活性和表型形態變化顯著增加。通過消耗 KIF3α 基因建立了一個沒有初級纖毛的細胞系，該基因的體內突變體與囊腫的形成有關，囊腫是一種嚴重的腎臟疾病。

總之，該研究的意義在于證明了FSS 誘導的PTECs生物學特性和活性的改善不是通過初級纖毛相關機制介導的。

參考文獻：Vriend J, Peters JGP, Nieskens TTG, Škovroňová R, Blaimschein N, Schmidts M, Roepman R, Schirris TJJ, Russel FGM, Masereeuw R, Wilmer MJ. Flow stimulates drug transport in a human kidney proximal tubule-on-a-chip independent of primary cilia. Biochim Biophys Acta Gen Subj. 2020 Jan;1864(1):129433. doi: 10.1016/j.bbagen.2019.129433. Epub 2019 Sep 11. PMID: 31520681.

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