止血是一種生理機制，旨在通過在受傷后形成血凝塊來維持血管完整性。一個健康內皮細胞的重要功能是通過對許多促凝和抗凝基因的精細調控來維持一個基本的抗血栓狀態。在由內皮細胞 (EC) 控制的多種促凝和抗凝途徑中，血栓調節蛋白 (TM) 是調節凝血和血栓形成的關鍵參與者。根據其抗凝和抗炎作用，TM與多種炎癥和缺血性病理有關，如靜脈血栓栓塞、出血性疾病、冠狀動脈疾病和動脈粥樣硬化等。

先前的研究表明，不同的外部刺激能夠轉錄調節 TM。層流剪切應力 (SS) 已被證明上調 TM 表達，而炎癥細胞因子如 TNF-α 通過轉錄因子 (TF) NF-κB 抑制 TM 表達。多個 TF 參與了TM表達的調控，包括 Krüppel 樣因子 2 (KLF2)。KLF2 已被證明可以在靜態、低SS 和高SS 條件下調節 EC 中的 TM 水平。由KLF2介導的高SS上調TM表達，這是大動脈中重要的保護性抗血栓和抗動脈粥樣硬化的機制。

然而，與內皮細胞TM的缺失不同，小鼠體內 KLF2 的缺失導致 TM 表達的適度降低，并不足以引起自發性血栓形成，這表明 KLF2 需要與其他 TF 合作來調節 TM 水平并發揮其抗血栓作用，可能是在選定的血管床上。

TF ETS-related gene (ERG) 是成人分化EC中E-26轉化特異性(ETS)家族中最豐富的成員，在所有血管床中都有表達。多項研究已經描述了 ERG 在內皮中的重要作用，比如調節血管發育和血管生成、促進血管穩態、抑制健康內皮細胞中的血管炎癥等。

基于此，來自英國帝國理工學院國家心肺研究所、美國賓夕法尼亞大學醫學院藥理學系等領域的研究團隊在 Nature Communications 上發表了題為《The transcription factor ERG regulates a low shear stress-induced anti-thrombotic pathway in the microvasculature》的文章。鑒于ERG的多重穩態功能，該實驗假設ERG可能在EC中具有抗血栓作用，從而保護血管免受自發性血栓的形成。
 

實驗結果：
 

首先，為了研究ERG發揮其抗血栓作用的分子機制，實驗使用了可誘導內皮缺失ERG (Erg ^iEC-KO )的成年小鼠。最后數據表明，在選定的血管床中，內皮TF ERG是防止自發性血栓形成的關鍵。ERG的缺失破壞了凝血的調節，導致肝和肺中與血栓和/或出血相關的凝血病。

其次，為了研究 ERG 發揮其抗血栓功能的分子機制，分析了 ERG 缺失的 HUVEC 的全局轉錄組譜，并確定了多個直接或間接參與凝血調節的基因作為ERG 的轉錄靶點。這些基因在 HUVEC 中進行了 qPCR 驗證。最后發現表明， ERG 可能以組織特異性的方式調節多種促凝和抗凝基因，并指出 TM 是 ERG 抗血栓作用的關鍵候選基因。

然后，為了測試在Erg ^iEC-KO 小鼠中觀察到的血栓表型是否是由于TM 表達的減少，實驗使用了靶向紅細胞 (RBC-TM) 的小鼠重組 TM 融合蛋白來恢復體內 TM 蛋白的活性。最后數據表明，用 RBC-TM 進行急性治療能夠顯著挽救在Erg ^iEC-KO小鼠中觀察到的凝血功能障礙。

接下來，實驗使用體外模型來研究 ERG 控制 TM 表達的機制。通過免疫印跡（圖1 b、c，圖2 b ) 和IF顯微鏡(圖1 d、e )檢測，與對照組siRNA相比，siRNA處理12、24 和 48h 抑制了HUVEC中 ERG表達，可導致TM mRNA（圖1 a和圖2 a）和蛋白表達下降。

ERG 還在人真皮微血管 EC（HDMEC）（圖1 d和圖2 d）和人真皮血液EC（HDBEC）（圖1 e）中調節微血管 EC 中 mRNA 和蛋白質水平的 TM 表達 。相反，ERG 過表達（圖2 e、f）顯著增加了 HUVEC 中的TM表達（圖1 f）。

TM 是凝血酶介導的天然抗凝劑 APC 5激活的關鍵調節劑。為了研究 ERG 對 TM 表達的調控是否導致其功能的調控，實驗對用 ERG siRNA 處理的 HUVEC 進行了蛋白 C 激活測定，并測量了APC 隨時間的產生。與降低的 TM 表達一致，ERG 缺失細胞（圖2 g，h）在與蛋白 C 孵育 30 分鐘后顯示出APC 的產生減少，與 siCtrl 細胞相比，在60 min時間點APC的生成減少最大(圖1 g)。

這些結果表明 ERG 調節 TM 水平，從而調節 EC 中的 TM-蛋白 C 系統。

圖 1

圖 2

在體外，實驗證明 ERG 與TM啟動子結合并轉化，并確定了一個ERG-KLF2 復合物，它協同驅動TM的表達；ERG 促進 KLF2 染色質進入、DNA 結合和TM 啟動子的反式激活。

盡管在體外靜態條件下，KLF2和TM在EC中表達，但它們是重要的血流響應基因:層流剪切應力(SS)上調KLF2的表達，進而促進TM的表達增加。但是，ERG是否是一個血流響應型TF尚不清楚。

接下來，實驗首先研究了低(5 dynes per cm²)和高(20 dynes per cm²)層流SS對HUVEC中ERG和KLF2蛋白水平的影響。正如預期的那樣，與靜態條件相比，暴露于低 SS和高 SS 的 HUVEC 中 KLF2 蛋白水平上調，相反，ERG 蛋白水平不受 SS 的影響（圖3 a）。與靜態條件相比，在低 SS 條件下 ERG-KLF2 復合物的形成增加，高 SS 沒有進一步增加這種相互作用（圖3 b）。

然后研究了 ERG 在使用 ERG 或對照 siRNA 處理的 HUVEC中，在靜態、低SS 、高 SS 條件下，在調節TM 表達中的作用。正如預期的那樣，與靜態條件相比，暴露于 SS 的 HUVEC 中KLF2和TM mRNA 水平上調，而ERG mRNA 水平不受影響（圖3 c）。

重要的是，雖然高SS誘導了在ERG缺失細胞中TM表達的上調，但低SS無法誘導其上調（圖3 c），表明ERG在低 SS 條件下選擇性地控制TM的表達，并且它對于高SS依賴性的TM調控是不可缺少的。

這些結果表明，ERG 和 KLF2 之間的合作對于 TM 在低 SS 條件下的表達是必不可少的，并表明其在高SS條件下，有其他基因/通路支持KLF2依賴性轉錄。

HUVEC 是體外使用最廣泛的 EC 模型，但不能概括來自不同血管床的 EC 的所有特性。因此，為了研究 ERG 在微血管或動脈來源的 EC 中 TM 的調節作用，實驗還對人微血管 EC（HDBEC）（圖3 d）和人主動脈內皮細胞（HAEC）進行了流動實驗。與 HUVEC 相比，HDBEC 實驗顯示出相似的結果，表明ERG在低SS條件下特異性調節TM的表達，在微血管EC中也是如此（圖3 d）。

圖 3

最后，實驗還發現，ERG 在暴露于低 SS 的微血管床中特異性調節 TM的 表達，但在暴露于高SS 的血管（主動脈）EC 中則不然。
 

實驗結論：
 

總之，研究表明 ERG 對于維持內皮抗血栓環境至關重要。實驗證明 ERG 是 TM 的直接轉錄調節因子，通過與 KLF2 合作以特定的方式驅動其表達。

鑒于血栓性疾病對特定器官的血管床表現出選擇性偏好，血管床特異性通路的識別對人類病理具有潛在的重要意義。該途徑可能參與與微血管血栓形成和/或凝血病相關的人類疾病的發病機制，例如彌散性血管內凝血、溶血性尿毒癥綜合征或敗血癥。


參考文獻：

Peghaire C, Dufton NP, Lang M, Salles-Crawley II, Ahnström J, Kalna V, Raimondi C, Pericleous C, Inuabasi L, Kiseleva R, Muzykantov VR, Mason JC, Birdsey GM, Randi AM. The transcription factor ERG regulates a low shear stress-induced anti-thrombotic pathway in the microvasculature. Nat Commun. 2019 Nov 1;10(1):5014. doi: 10.1038/s41467-019-12897-w. PMID: 31676784; PMCID: PMC6825134.

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