全球有超過50000種人類相關的遺傳疾病，其中大部分是由基因組的點突變引起的。而對于罕見病而言，80%是由基因缺陷引起的，同時這些基因缺陷中點突變又占了60%。比如，我們熟悉的鐮刀型紅細胞貧血癥就是由于β-globin基因編碼區上的一個堿基位點發生突變引起的；又比如多發性神經纖維瘤（Neurofibromatosis）則是由 Neurofibromin 1/2基因發生堿基突變引起的。由此可以看出，對基因組點突變的研究不僅能揭示一些重要的生物學原理，更有利于人類疾病治療手段的研發。

什么是點突變

點突變是基因突變的一種，廣義的點突變包括所有單個堿基的改變，即缺失、插入和替換。而狹義的點突變主要指單個堿基的替換。嘌呤之間和嘧啶之間的替換叫做轉換，而嘧啶與嘌呤之間的替換則叫顛換。以上說的都是DNA分子層面的改變，如果把視角擴展到染色體的層面，則存在染色體數量改變和染色體結構變異兩種。

圖1. 點突變的方式。

點突變對氨基酸及其構成的蛋白質結構和功能的影響分為三種，即同義突變、無義突變和錯義突變。一般情況下，在相同的位點，無義突變對蛋白質影響最大，錯義突變的非保守型突變次之，接下來是錯義突變中的保守型突變，同義突變本身對蛋白質功能無影響。

圖2. 點突變對氨基酸的影響。

點突變疾病模型的構建

研究點突變相關遺傳疾病，免不了要構建細胞模型和動物模型，而我們在構建細胞點突變模型時的理論基礎便是基因的同源重組修復。當細胞基因組DNA雙鏈由于外部因素而斷裂時，細胞中存在著一種DNA修復機制就會被激發，對斷裂位點的DNA雙鏈進行修復，根據修復方式的不同可分為同源重組修復和非同源重組修復。顧名思義，同源重組是指DNA在修復的過程中以同源的DNA序列作為模板完美修復，而非同源重組修復是指細胞內的相關蛋白直接將斷裂的DNA兩端重新連起來，同時可能會隨機引入新的堿基。

圖3. DNA雙鏈斷裂修復途徑。A)同源重組修復，B)非同源重組修復。

根據這個理論基礎，點突變細胞系的構建分為三個部分：

1. 定點切割DNA

由于在自然界中DNA的斷裂是隨機的，不確定的，因此我們需要人為的定點對DNA產生切割。在這個過程中，CRISPR-Cas9技術給我們提供了極大的便利。我們可以通過人為的設計sgRNA，并將Cas9蛋白與sgRNA一起轉染到目的細胞中。在sgRNA的引導下，Cas9蛋白對靶位點處的DNA進行切割，產生DNA雙鏈斷裂。

2. 同源重組修復DNA

我們通過CRISPR-Cas9技術對細胞內的基因組DNA產生了雙鏈斷裂后，同時引發了細胞內的DNA修復機制。因此，為了使DNA在修復過程中能通過同源重組的方式修復DNA并引入突變位點，我們需要為細胞提供額外的同源修復模板。這個模板的本質是人為合成的DNA序列，由5’端同源臂、突變位點和3’端同源臂組成。值得注意的是，這種同源模板序列是隨sgRNA和Cas9蛋白一起轉染進細胞的。

3. 陽性細胞篩選

這部分是細胞模型構建的關鍵部分。試想下，我們通過細胞轉染技術將CRISPR-Cas9系統和模板DNA序列轉入細胞中后，由于細胞內部機制的作用，我們得到的細胞池中既包含純合子陽性細胞和雜合子細胞，又包含沒有發生堿基突變的野生型細胞。那么，我們該如何挑選出目的細胞將是關鍵。對于點突變模型來說，由于沒有引入抗性基因，常用的方法便是通過稀釋法將細胞池細胞稀釋轉移到96孔板中，形成單克隆細胞。然后收集單克隆細胞進行大量測序，以得到預期的純合子細胞。

由于人類疾病中基因產物并非總是如轉基因一樣的高表達，也不是像基因敲除一樣完全不表達。很多情況下只是由于單個或者少數幾個堿基的改變而造成的蛋白結構改變，表現為非正常激活或者抑制。因此，構建精細的與疾病對應的點突變模型便成為了疾病臨床前研究的最佳方案。而現在的CRISPR-Cas9技術也使得我們能夠以更低的成本和功能高的效率將之實現。賽業生物基于CRISPR-Cas9技術自主開發的Smart-CRISPR™細胞基因編輯系統，采取更有效的設計方案，高同源重組效率和無隨機插入細胞基因組的風險，適用于多種細胞，成功率高，經大量測試和優化后的實驗工藝，可以更快交付基因敲入和點突變細胞株，加速您的實驗進展！

現在Smart-CRISPR細胞基因編輯技術全新升級，凡訂購點突變、基因敲入細胞株服務的客戶均可享優惠價。

活動時間：2021年6月10日——2021年7月31日

活動對象：全國科研終端客戶

作為基因改變相關疾病最主要的誘因，針對點突變的研究不論是在先天的遺傳疾病還是后天突變導致的腫瘤中都具有重要的意義。除了點突變細胞模型外，賽業生物還可以為您提供提供優質的點突變大小鼠模型，賽業生物紅鼠庫通過對上千例Crispr項目進行深度學習，綜合gRNA切割位點、點突變位置、oligo長度、同義突變個數、所在位點Cas9切割效率以及脫靶率等因素，智能化生成gRNA設計方案。

此外針對通常條件下，細胞偏向于使用非同源末端連接的方式對斷裂的雙鏈進行修復，進而造成靶位點基因的插入/缺失突變。賽業生物團隊在 Crispr/Cas9 技術的基礎上創新性研發出 CRISPR-Pro 基因修飾技術，采用獨特的受精卵處理方式讓受精卵偏好同源重組修復路徑，進而提高同源重組效率。

圖4. 點突變小鼠數據庫及定制平臺。

參考文獻：

1. Wu WH, Tsai YT, Justus S, Cho GY, Sengillo JD, Xu Y, Cabral T, Lin CS, Bassuk AG, Mahajan VB, Tsang SH. CRISPR Repair Reveals Causative Mutation in a Preclinical Model of Retinitis Pigmentosa: A Brief Methodology. Methods Mol Biol. 2018;1715:191-205. doi: 10.1007/978-1-4939-7522-8_13. PMID: 29188514.

2. Peng G, Lin SY. Exploiting the homologous recombination DNA repair network for targeted cancer therapy. World J Clin Oncol. 2011 Feb 10;2(2):73-9. doi: 10.5306/wjco.v2.i2.73. PMID: 21603316; PMCID: PMC3095467.