想調整研究方向，獲得學術研究突破口？想獲得論文選題思路，提高發文命中率？你需要了解學科發展態勢和未來走向！賽業生物專欄《Gene of the Week》每周二會根據熱點研究領域介紹一個基因，詳細為您介紹基因基本信息、研究概況和應用背景等，助您保持學術研究敏銳度，提高科學研究效率，期待您的持續關注哦。今天我們要講的主角是免疫研究熱門基因之CD39。

基因基本信息

備注：標有√的意為賽業紅鼠資源庫有該種保存狀態的小鼠

CD39的功能簡介

CD39，也稱為膜外三磷酸腺苷二磷酸水解酶-1（Ectonucleoside triphosphate diphosphohydrolase-1），由ENTPD1基因編碼而成。CD39是一個跨膜蛋白，具有兩個跨膜結構域和一個胞外結構域。CD39的活性中心在胞外結構域上，但有研究表明兩個跨膜結構域之間的互相作用也會影響酶活性[1]。功能上，CD39能與胞外ATP（extracellular ATP，eATP）結合，并將其水解為AMP；另一種胞外核酸酶CD73則會將AMP水解為腺苷（adenosine，ADO）。在ATP-ADO通路中，CD39是eATP水解的限速酶，而CD39是AMP水解的限速酶（圖1）。此外，CD39也能將水解ADP，但效率較低[3]。

圖1. TME中的ATP-ADO通路[2]。

在腫瘤微環境（tumour microenvironment，TME）中，累積的eATP能通過P2嘌呤受體 (P2XRs和P2YRs) 刺激細胞炎癥反應，或通過胞外核苷酸酶CD39和CD73被降解為免疫抑制性的ADO。在缺氧的TME中，CD39和CD73在多種細胞類型中廣泛表達，且表達量上調。在特定組織或腫瘤類型中，ADO也能通過其它途徑產生，例如堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）介導的ATP分解，或由CD38、CD203a 和CD73對NAD+進行順序分解代謝產生。此外，高濃度的胞外ADO能通過腺苷受體(A2A、A2B等）促進TME中的免疫抑制性微環境，且胞外ADO濃度由腺苷脫氨酶（adenosine deaminase，ADA）調控，ADA能將ADO轉化為肌苷。

CD39的表達

CD39在多種免疫細胞和非免疫細胞（e.g., 內皮細胞和成纖維細胞）中均有表達，且CD39和其下游的ADO受體在受到包括組織損傷、缺氧和組織重塑等多種刺激下，也會上調表達水平。此外，腫瘤細胞也進化出了通過上調CD39表達量來消耗具有免疫激活作用的eATP的免疫逃逸機制。在淋巴瘤、肉瘤、肺癌等多種腫瘤中，研究人員都觀測到了CD39表達水平升高。在腫瘤微環境（tumour microenvironment，TME）中，血管內皮細胞和一些免疫細胞亞群也會高表達CD39，例如NK細胞、CD4+ CD25+ 調節性T細胞 (Treg)、巨噬細胞等。其中，血管內皮細胞上CD39的表達在血管生成（angiogenesis）和原代腫瘤生長中都扮演了重要角色[4]。

eATP和ADO在TME中的作用

eATP和ADO已被證明在TME中分別有促炎作用和免疫抑制作用[5]。在TME中，它們間的平衡調控著多種細胞的免疫應答反應（圖2）。CD73拮抗劑或A2ARi都只注重逆轉ADO的免疫抑制作用，而低估了eATP在其中起到的功效；靶向CD39的療法則有從多方面調控腫瘤免疫反應的潛力[2]。

圖2. TME中ATP與ADO的“陰”與“陽”[2]。

TME中，eATP與胞外ADO一起調控多種細胞的免疫應答反應：促炎（pro-inflammation）或促腫瘤生長（pro-tumor）。eATP通過嘌呤受體在多種細胞類型中發揮免疫激活作用；而ADO通過ADO受體介導的多種機制在同樣的細胞中抑制免疫反應。

CD39抑制劑的抗腫瘤免疫機制

理論上，在ATP-ADO通路中抑制CD39具有雙重抗腫瘤免疫效果：①通過抑制ATP的水解，提高TME中有促炎和促細胞增殖作用的ATP水平；②通過抑制下游產物ADO的累積，逆轉ADO受體直接介導的免疫抑制作用及長期建立的免疫抑制性TME[2]。此外，還有研究人員發現了一些其他的機制（圖3）。

圖3. 在TME中治療性抑制CD39胞外核苷酸酶活性能通過多種機制提升抗腫瘤免疫效果[2]。

（a）TME中的多種細胞表達CD39，從而促進胞外核苷酸酶介導的eATP分解代謝，包括CD4+ CD25+ Treg、耗竭T細胞、髓系來源抑制細胞（myeloid-derived suppressor cells，MDSCs）、內皮細胞、B細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞（dendritic cells，DCs）、NK細胞和腫瘤細胞。由于缺氧，細胞損傷或細胞死亡而導致的eATP持續釋放，以及通過抑制CD39來抑制ATP降解，都會導致TME中eATP含量的增加。

（b）除了提高eATP的累積量以外，抑制CD39的酶活性也會減少ADO的累積量，從而降低各種駐留和浸潤免疫細胞的免疫抑制作用，例如表達A2A和/或A2B受體的NK細胞和T細胞。

（c）eATP水平上調能激活髓系細胞中的P2X7，促進炎癥小體（inflammasome）介導的包括IL18和IL-1β在內的促炎細胞因子的釋放，從而支持效應T細胞（Teff）和NK細胞介導的細胞毒性作用。eATP水平上調也能誘導P2X7+ 巨噬細胞的細胞焦亡（pyroptosis）。

（d）此外，eATP與DCs上的P2X7結合能增強抗原呈遞作用，并促進DC的成熟，進一步支持抗腫瘤免疫作用。

靶向CD39的聯合免疫療法

除了單藥免疫療法，利用療效“1+1>2”的聯合免疫療法也越來越火熱。目前，也有多種靶向CD39的聯合免疫療法處于實驗及臨床試驗階段（圖4）。

圖4. 靶向CD39的聯合免疫療法[2]。

（a）同時阻斷CD39和其他ATP-ADO通路中的蛋白（CD73, A2A/A2B受體和CD38）可以通過①提高具有免疫激活作用的eATP水平、②抑制具有免疫抑制作用ADO的生成，來提高治療效果。此外，阻斷ATP-ADO通路中的多種蛋白能降低可能存在的代償機制的影響，以及降低靶向單一蛋白可能無法完全阻斷該通路的風險。

（b）同時阻斷CD39和其他免疫檢查點（例如PD-1、PD-L1和CTLA-4等）在臨床前模型中顯示出了聯合抗腫瘤療效。此外，在一些靶細胞中，CD39與免疫檢查點共表達。例如，在耗竭T細胞中，CD39與PD-1共表達；在巨噬細胞中，CD39與PD-L1共表達。

（c）由化療或放療引起的腫瘤細胞死亡會增加eATP和腫瘤抗原的釋放，而同時進行CD39阻斷能維持TME中eATP 的高含量，提高DCs的抗原呈遞效果，增強抗腫瘤免疫作用。

（d）過繼性細胞療法（例如CAR-T）的抗腫瘤效果可能會被適應性耐藥機制所限制，包括CD39的上調或形成低eATP/高ADO的TME。靶向CD39、CD73和/或PD-1能減弱這種耐藥機制，提高抗腫瘤免疫效果。

（e）降低胞外ADO水平也能提高表達Fc受體的效應細胞的效應作用。降低對巨噬細胞和NK細胞的抑制作用可以分別提高腫瘤抗原介導的抗體依賴性細胞毒性（antibody-dependent cellular cytotoxicity，ADCC）和抗體依賴性細胞吞噬作用（antibody-dependent cellular phagocytosis，ADCP)。

小結

靶向TME中的ATP-ADO通路是一種非常有前景的療法。而其中，CD39抑制劑在TME中具有雙重抗腫瘤免疫效果：①提高具有免疫激活性的eATP水平；②減少具有免疫抑制性的ADO累積。目前，多種CD39抑制劑已進入臨床試驗階段：例如，由Innate Pharma/Astrazeneca公司研發的IPH5201、由Tizona Therapeutics公司研發的TTX-030和由Surface Oncology公司研發的SRF617。此外，由科望醫藥(Elpiscience) 研發的ES002、由Secarna公司研發的靶向CD39的反義寡核苷酸（antisense oligonucleotide，ASO）等也正處于臨床前研究階段。

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CD39人源化小鼠助力腫瘤研究

品系背景：C57BL/6N、BALB/c

品系構建策略：

在小鼠CD39基因位點敲入人源CD39胞外域序列，保留小鼠胞內域和跨膜域，構建嵌合型CD39人源化小鼠模型。

品系說明：

■ CD39在小鼠體內具有正常的生理表達和調節模式。

■ CD39胞外域人源化，利于hCD39靶向藥物的識別。

■ 保留小鼠CD39胞內域，保證正常的胞內信號轉導。

■ 小鼠靶基因不表達，避免交叉反應。

■ 小鼠的免疫系統功能健全。

研究應用：

本模型可用于評估hCD39靶向藥物在免疫健全小鼠體內的有效性及安全性。

模型驗證：

CD39表達檢測

圖1. hCD39在hCD39小鼠中的表達模式與mCD39在野生型小鼠中的表達模式一致。

hCD39和mCD39在新鮮分離的脾細胞中的表達情況：（A）樹突狀細胞（CD3- CD19- CD11b+ CD11c+）、（B）B細胞（CD3- CD19+）和（C）Tregs（viable, CD3+ CD4+ CD25+ Foxp3+）。

CD39功能檢測

圖2. hCD39是有功效的：αhCD39抗體能特異性降低hCD39的活性。

用αmCD39抗體、αhCD39抗體或作為對照組的ARL（胞外核苷酸酶抑制劑）對（A）野生型小鼠和（B）hCD39小鼠新鮮分離的脾細胞處理1h。加入ATP后，通過CellTiter-Glo®發光細胞測定法測量ATP水平。

參考文獻：

[1] Grinthal, A., Guidotti, G. CD39, NTPDase 1, is attached to the plasma membrane by two transmembrane domains. Why? Purinergic Signal 2, 391-8(2006).

[2] Moesta, A.K., Li, XY. & Smyth, M.J. Targeting CD39 in cancer. Nat Rev Immunol 20, 739–755 (2020).

[3] Antonioli, L., Pacher, P., & Vizi, E. S., et al. CD39 and CD73 in immunity and inflammation. Trends in molecular medicine, 19(6), 355–367(2013).

[4] Jackson, S.W., Hoshi, T. & Wu Y., et al. Disordered purinergic signaling inhibits pathological angiogenesis in cd39/Entpd1-null mice. The American journal of pathology 171, 1395–1404(2007).

[5] Stagg, J., Smyth, M. Extracellular adenosine triphosphate and adenosine in cancer. Oncogene 29, 5346–5358 (2010).