二血管阻塞慢性腦缺血模型

本文介紹模擬慢性腦血流低灌注所致病理生理改變及認(rèn)知障礙的嚙齒類動(dòng)物模型，包括大鼠雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎和小鼠雙側(cè)頸總動(dòng)脈狹窄模型。其中，大鼠雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎模型通過(guò)結(jié)扎大鼠雙側(cè)頸總動(dòng)脈實(shí)現(xiàn)，小鼠雙側(cè)頸總動(dòng)脈狹窄通過(guò)在小鼠的雙側(cè)頸總動(dòng)脈植入鋼制線圈實(shí)現(xiàn)。結(jié)扎大鼠雙側(cè)頸總動(dòng)脈造成腦血流的下降并能較好模擬慢性缺血所致的病理改變，操作簡(jiǎn)單、重復(fù)性好、死亡率低，被廣泛用于慢性腦缺血的研究。該模型可造成脫髓鞘改變、軸突丟失、膠質(zhì)細(xì)胞增生等白質(zhì)損傷的病理改變。

此外，將結(jié)扎大鼠雙側(cè)頸總動(dòng)脈與降低平均動(dòng)脈壓(降至50mmHg)結(jié)合，并在缺血10~30min后重新恢復(fù)血供，可用于模擬前腦缺血。該模型可引起腦內(nèi)易感腦區(qū)神經(jīng)元的選擇性、延遲性死亡，包括新皮質(zhì)、海馬CA1區(qū)的錐體神經(jīng)元以及尾側(cè)殼核。其中，海馬神經(jīng)元損傷與記憶受損及認(rèn)知障礙密切相關(guān)。該模型所致的神經(jīng)元選擇性損傷可通過(guò)組織學(xué)和行為學(xué)檢測(cè)方法進(jìn)行評(píng)估。二血管結(jié)扎模型手術(shù)步驟簡(jiǎn)單、再灌注操作容易，故較四血管結(jié)扎模型更具優(yōu)勢(shì)。

一、動(dòng)物選擇

大鼠

• 在建立大鼠二血管結(jié)扎的動(dòng)物模型時(shí)，必須考慮動(dòng)物的品系、性別以及年齡。由于雌激素對(duì)缺血結(jié)果有影響，通常選用雄性大鼠。在二血管結(jié)扎的動(dòng)物模型中，最常用的動(dòng)物是250~300g的雄性 Wistar大鼠。Sprague-Dawley(SD)大鼠和其他品系的大鼠亦可用于本模型的制作。

小鼠

• 常采用雄性C57BI/6小鼠，體重為24-30g。此外，沙鼠是較為常用的品系。由于轉(zhuǎn)基因和基因敲除小鼠大多來(lái)源于C57BI/6品系，為了研究基因在慢性腦缺血病理生理機(jī)制中發(fā)揮的作用，故目前多用C57BI/6小鼠制作該動(dòng)物模型。

二、制作步驟

1.大鼠手術(shù)操作步驟

• 所有操作均在無(wú)菌條件下進(jìn)行。手術(shù)人員應(yīng)戴口罩和無(wú)菌手套，穿無(wú)菌隔離衣。術(shù)前所有手術(shù)器械均應(yīng)滅菌且在手術(shù)過(guò)程中存放在無(wú)菌溶液中，如惡霉靈溶液。

(a)大鼠頭頸部血管及結(jié)扎部位示意圖；

(b)動(dòng)物呈仰臥位；

(c)頸部正中切口，暴露氣管和雙側(cè)頸總動(dòng)脈，用眼科鑷分離并挑起頸總動(dòng)脈；

(d)暴露一側(cè)頸總動(dòng)脈，將一根外科絲縫線結(jié)扎頸總動(dòng)脈用同樣的方法分離并結(jié)扎另一側(cè)頸總動(dòng)脈

(1)將大鼠放入麻醉箱中，用含2%異氟醚的70%氧化亞氮和30%氧氣的混合氣體以5L/min的氧氣流速進(jìn)行麻醉誘導(dǎo)，3~5min后，大鼠進(jìn)入麻醉狀態(tài)，之后以1L/min的氧氣流速進(jìn)行維持。

(2)術(shù)前褪毛，聚維酮碘常規(guī)消毒手術(shù)區(qū)域。

(3)為了控制平均動(dòng)脈壓、動(dòng)脈血?dú)饬亢脱�糖含量，�?yīng)同時(shí)行尾動(dòng)脈插管。把2根電極通過(guò)小的皮膚切口插入雙側(cè)顳肌，以獲取腦電圖。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)中，平均動(dòng)脈血壓和腦電圖的獲取依賴動(dòng)力實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)。

(4)通過(guò)尾動(dòng)脈抽取動(dòng)脈血，運(yùn)用動(dòng)脈血?dú)怏w分析儀和血漿葡萄糖測(cè)定儀，對(duì)血?dú)夂脱�糖含量進(jìn)行測(cè)定。

(5)在缺血前15min和缺血后15min對(duì)動(dòng)脈血?dú)夂脱�糖含量進(jìn)行測(cè)定，在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中血液氣體含量都保持在正常的生理范圍內(nèi)。

(6)在大鼠腹側(cè)頸部皮膚正中線處做一個(gè)切口，小心分離兩側(cè)的頸總動(dòng)脈和周圍組織以及迷走神經(jīng)。

(7)把直腸溫度探測(cè)器插入到直腸中監(jiān)測(cè)體溫。熱電耦33G溫度探測(cè)器植入顳肌，監(jiān)測(cè)頭部溫度。在動(dòng)物身體和頭部上方的熱光源的幫助下，身體和頭部溫度在整個(gè)手術(shù)過(guò)程中保持在(37±0.2)℃。

(8)當(dāng)所有的準(zhǔn)備工作已經(jīng)完成時(shí)，異氟醚的濃度保持在1%。

(9)在缺血前15min，監(jiān)測(cè)血壓中的氣體含量，平均動(dòng)脈血壓、腦電圖、直腸和頭部溫度，并且保持在正常的生理范圍內(nèi)。

(10)將兩側(cè)頸總動(dòng)脈通過(guò)外科絲縫線5-0結(jié)扎以誘導(dǎo)腦血流低灌注。

(11)縫合皮膚，結(jié)束麻醉過(guò)程。大鼠仍然需要進(jìn)行70%氧化亞氮和30%氧氣的混合氣體輔助呼吸，并且保持顳肌和直腸的溫度在37℃，直到它從麻醉狀態(tài)清醒過(guò)來(lái)，此過(guò)程通常需要30~60min。移除頭部和直腸溫度探測(cè)器后，把大鼠放回到其原來(lái)的籠子。

(12)密切監(jiān)控大鼠呼吸，直到呼吸恢復(fù)平穩(wěn)。1~2h后，大鼠可以轉(zhuǎn)移至動(dòng)物房，常規(guī)供應(yīng)食物和水。

(13)頸總動(dòng)脈閉塞分步法：為避免腦血流量突然出現(xiàn)相對(duì)嚴(yán)重的下降，可按以下步驟逐步閉塞頸總動(dòng)脈。大鼠用異氟醚麻醉，頸腹正中切口。暴露左側(cè)頸總動(dòng)脈，與迷走神經(jīng)輕輕分離，用三條結(jié)扎線(2-0)閉塞。1周后，做一個(gè)新的切口，右頸動(dòng)脈同樣被阻塞。

2.小鼠手術(shù)操作步驟

• 由于小鼠不能結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈，在小鼠腹側(cè)頸部皮膚正中線處作一個(gè)切口，手術(shù)顯微鏡下小心分離兩側(cè)的頸總動(dòng)脈和周圍組織以及迷走神經(jīng)。用內(nèi)徑0.18~0.22mm、長(zhǎng)度2.5mm的特制鋼制微線圈分別纏繞在雙側(cè)頸總動(dòng)脈分叉部的近心端以誘導(dǎo)腦血流低灌注�？p合皮膚，結(jié)束麻醉過(guò)程。小鼠仍然需要進(jìn)行70%/30%的氧化亞氮/氧氣輔助呼吸，并且保持顳肌和直腸溫度在37℃，直到它從麻醉狀態(tài)清醒過(guò)來(lái)，此過(guò)程通常需要30~60min。密切監(jiān)控小鼠呼吸，直到呼吸恢復(fù)平穩(wěn)。30~60min后，小鼠可以放回籠中，常規(guī)供應(yīng)食物和水。因小鼠的Wlls環(huán)后交通動(dòng)脈常缺如，同時(shí)結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈，因椎基底動(dòng)脈系統(tǒng)血流不能代償頸動(dòng)脈系統(tǒng)腦血流的劇烈下降，至腦組織缺血缺氧，極易造成動(dòng)物的迅速死亡。

(a)小鼠頭頸部血管及鋼制微線圈置入部位示意圖；

(b)鋼制微線圈實(shí)物圖；

(c)頸部正中切口暴露氣管和右側(cè)頸總動(dòng)脈，用眼科鑷分離并挑起右側(cè)頸總動(dòng)脈將鋼制微線圈纏繞在頸總動(dòng)脈分叉部的近心端；

(d)顯微鏡下

(e)圖的放大圖，箭頭所指即鋼制微線圈

三、注意事項(xiàng)及常見問(wèn)題解答

1.注意事項(xiàng)

• 以下要點(diǎn)對(duì)于二血管結(jié)扎的慢性腦缺血模型組織損傷的重復(fù)性非常重要：

1. 在手術(shù)過(guò)程中，直腸和大腦的溫度必須控制在(37±0.2)℃。大腦的溫度尤其重要，因?yàn)闆](méi)有血供會(huì)引起大腦溫度的下降；而大腦溫度的微小變化對(duì)于缺血引起的組織學(xué)損傷會(huì)產(chǎn)生顯著的影響。
2. 手術(shù)前夜對(duì)小鼠禁食以維持血糖水平的穩(wěn)定同樣非常重要。卒中前高水平血糖通常會(huì)引起更加嚴(yán)重的神經(jīng)元損傷。

2.常見問(wèn)題及解決方法

• 死亡大部分是由于術(shù)后并發(fā)癥所導(dǎo)致。頸總動(dòng)脈和迷走神經(jīng)分離不清，誤傷迷走神經(jīng)導(dǎo)致動(dòng)物呼吸困難。手術(shù)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)和手術(shù)過(guò)程中的不仔細(xì)同樣會(huì)引起功能修復(fù)困難。此外，過(guò)度麻醉會(huì)引起動(dòng)物在手術(shù)時(shí)死亡（如何讓動(dòng)物實(shí)驗(yàn)安全平穩(wěn)進(jìn)行，點(diǎn)擊查看解決方案）。因此，熟練操作，仔細(xì)分離頸總動(dòng)脈是提高生存率的重要因素。

*以上內(nèi)容部分源自《實(shí)驗(yàn)卒中模型方法學(xué)》

書號(hào)：ISBN 978-7-313-21776-9

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