腸道是人體重要的消化吸收的場所，也是最大的免疫器官。腸道微生物組、免疫細胞和粘膜屏障共同筑成了腸道上皮的穩態，是人體健康的重要防線之一。這里和大家一起精讀一篇發表在Journal of Experimental Medicine雜志上的文獻，該研究首次揭示了通過小腸上皮細胞（IEC）來調節T細胞分化（IEL，上皮內淋巴細胞）的分子機制，此外，研究發現微生物群對于小腸中MHCII和PD-L1以及IEL的上皮分化至關重要。

 

小腸中，經典CD4+ T細胞可分化為CD4+ CD8αα+上皮內淋巴細胞（intraepithelial lymphocytes, IELs），但是它們周圍的小腸上皮細胞（intestinal epithelial cells，IECs）在其中的作用還不明確。近日，Dr. Moon帶領的韓國團隊研究發現：在小腸遠端，IECs在微生物群和IFN-γ的刺激下能通過表達MHC II類分子和程序性死亡配體-1（programmed death ligand-1，PD-L1），提供生態龕（niche）適應信號，來促進CD4+CD8αα+IELs（DP IELs）的分化。 這一研究結果發表在了Journal of Experimental Medicine雜志上[1]。

 

備注：下文中的SP表示CD4+單陽性（single positive）細胞；DP表示CD4+CD8+ 雙陽性（double positive）細胞。

 

IELs的分化需要IECs上MHC II的表達

為了探究IECs在DP IELs分化過程中起到了非典型APC的作用，研究者們分析了C57BL/6野生型小鼠小腸不同部位中，MHC II在IECs上的表達情況。一系列的流式實驗、RNA-seq實驗都顯示IECs在DP IELs分化過程中的作用與MHC II抗原呈遞相關。此外，為了弄清楚IECs表達的MHC II在DP IELs分化中的作用，研究者們使用了一種特異性在IECs中敲除了MHC II的小鼠（MHC II△IEC），并通過與MHC IIfl/fl對照組小鼠相比，證實了IELs的分化需要IECs上MHC II的表達（圖1G-H）。

圖1G-H. 流式（G）和免疫熒光實驗（H）都顯示：與MHC IIfl/fl對照組小鼠相比，MHC II△IEC小鼠的DP IELs在SP IELs細胞中的比例顯著下降。此外，免疫熒光實驗（H）顯示，大部分DP IELs都與高表達MHC II的上皮細胞的基底外側面相接觸。

 

MHC II在IECs上的表達依賴于IFN-γ的存在

有報道顯示IFN-γ在非造血細胞（例如IECs）中能強效誘導MHC II的表達。為了進一步驗證這個結論，研究者們使用了一款IFN-γ受體敲除小鼠（IFN-γR−/−）。與前人的實驗結論一致：在IFN-γR−/−小鼠的IECs上，未檢測到MHC II的表達，而且DP IELs分化嚴重受阻，其在SP T細胞中的比例幾乎為0（圖2A）；在野生型小鼠中，加入anti-IFN-γ抗體后，MHC II的表達水平以及DP在SP IELs細胞中的比例都顯著降低（圖2B）。此外，有報道顯示IFN-γ是DP IELs分化所必需的：它能通過誘導轉錄因子T-bet的表達，促進DP IELs的分化。這說明IFN-γ在DP IELs的功能成熟中起到了重要作用。

圖2A-B. IFN-γ在非造血細胞（例如IECs）中能強效誘導MHC II的表達。

 

為了探究IELs和IECs中，IFN-γ對DP IELs分化的影響，研究者們構建了骨髓（Bone marrow，BM）嵌合體小鼠：從供體小鼠的腿骨中取得BM細胞，靜脈注射到經致死劑量輻照后的受體小鼠體內（供體小鼠的造血細胞→受體小鼠），8周造血重建期過后處死受體小鼠。結果顯示（圖2C）：無論是在造血細胞（例如CD4+IELs），還是非造血細胞（例如IECs）中，DP IELs的分化都需要完整的IFN-γR信號。此外，之前在野生型小鼠中觀察到的不同小腸部位中MHC II表達量和DP IELs比例的明顯差異，在BM嵌合型小鼠中都未能觀測到。研究者們推測這有可能是因為免疫重建后的受體小鼠比穩態時產生了更多的IFN-γ，而這改變了腸道微環境，使其炎癥化，因此消除了這種區域性差異。

圖2C. DP IELs的分化需要完整的IFN-γR信號。

 

為了直接探究MHC II+IECs是否在DP IELs分化中起到了非典型APC的作用，研究者們構建了分別來源于IFN-γR+/+小鼠和IFN-γR−/−小鼠的小腸類器官（orgnoids）。他們首先驗證了IFN-γ在類器官中能發揮與體內一致的效果：IFN-γ能強效誘導類器官中IECs上MHC II的表達（圖2D-E）。此外，有研究顯示，T-box expressed in T cells （T-bet）是DP IELs分化過程中的重要上游調控因子，它能誘導Runx3的表達并抑制ThPOK 的表達；而T-bet誘導產生的細胞因子（例如IFN-γ）在腸道微環境刺激因子的存在下，能進一步促進DP IELs的分化。因此，研究者們在腸道微環境刺激因子TGF-β和視黃酸（Retinoic acid,RA）存在的情況下，將經IFN-γ和卵清白蛋白多肽（ovalbumin peptide，OVAp）預刺激后的小腸類器官，以及經anti-CD3ε/CD28預刺激后的OVA特異性CD4+ T細胞（OT-II）進行24h共培養（圖2F）。結果顯示：IFN-γ能誘導MHC II大量表達；MHC II+IECs在DP IELs分化中起到了非典型APC的作用，且TGF-β和RA刺激能進一步促進DP IELs的分化。

圖2D-E. 流式（D）和免疫熒光實驗（E）顯示：進行IFN-γ刺激后，IFN-γR+/+小鼠來源的類器官IECs上的MHC II表達水平顯著升高，而IFN-γR−/−小鼠來源的類器官IECs上的MHC II不表達。

 

圖2F-G. 共培養實驗示意圖（F）；IECs上MHC II的表達情況（G左）；DP在SP OT-II細胞中的比例（G右）。

 

IECs上經IFN-γ誘導產生的PD-L1在DP IELs分化中起到重要作用

通過上述實驗知道MHC II+IECs能作為APC對CD4+IELs進行同源刺激后，研究者們推測它們也能表達其他能與MHC II一起協同調節T細胞的共受體。此外，由于MHC II在IECs上的表達依賴于IFN-γ的存在，研究者們進一步推測這些共受體應該與IECs中的IFN-γ信號有關。對經IFN-γ處理或不處理的小腸類器官進行RNA-seq分析，研究者們發現編碼PD-L1蛋白的Cd274基因與MHC II關聯基因的表達顯著相關（圖3A-B）。類器官實驗（圖3C）和體內實驗（圖3D-E）都表明IFN-γ能顯著影響PD-L1表達量。為了進一步證實DP IELs分化需要IECs上PD-L1的表達，研究者們使用了PD-L1敲除小鼠（PD-L1−/−）、RAG-1敲除小鼠（RAG-1−/−，小鼠無成熟T、B細胞）、特異性在IECs中敲除了PD-L1目的基因的小鼠（PD-L1△IEC）以及由賽業生物構建的PD-L1fl/fl對照組小鼠。一系列實驗結果（圖F-H）都顯示IECs上的PD-L1在DP IELs分化中起到了重要作用。

圖3A-B. 差異表達基因熱圖（A）和火山圖（B）。

 

圖3C-E. （C）經不同濃度IFN-γ處理后，小腸類器官PD-L1的表達量;（D）與IFN-γR+/+小鼠對比，IFN-γR−/−小鼠中的PD-L1表達量顯著降低；（E） 在IFN-γR+/+小鼠體內注射anti-IFN-γ抗體后，IECs上PD-L1的表達量顯著降低。

 

圖3F-H. （F）與PD-L1+/+小鼠對比，在PD-L1−/−小鼠回腸中，DP IELs比例明顯下降；（G）將脾CD4+ T細胞輸入到RAG-1−/−小鼠體內后，在小鼠體內加入anti-PD-L1抗體，DP IELs發育受阻；（H）與PD-L1fl/fl小鼠對比，在PD-L1△IEC小鼠回腸中，DP IELs比例明顯下降。

 

微生物群對小腸中MHC II和PD-L1的表達以及DP IELs的分化至關重要

有報道顯示小腸中IFN-γ的產生以及IECs上MHC II的表達都需要微生物群，因此，為了探究IECs上PD-L1的表達是否受到微生物群調控，研究者們使用了無菌（Germ-free，GF）小鼠、無特定病原體級（specific pathogen–free，SPF） 小鼠進行實驗。這些實驗結果表明：微生物群誘導產生的IFN-γ能刺激IECs表達MHC II和PD-L1，而這兩者可以調節DP IELs的分化。

圖4A. 與SPF小鼠對比，GF小鼠IECs上PD-L1的表達水平在回腸中顯著降低、MHC II表達量和DP IELs比例在小腸各部位顯著下降，特別是在回腸中。

 

圖4B. 進行抗生素處理后，SPF小鼠中IECs上PD-L1的表達水平在回腸中顯著降低、MHC II表達量和DP IELs比例在小腸各部位顯著下降，特別是在回腸中。

 

圖4C. 免疫熒光實驗顯示：SPF小鼠回腸中的IECs大多數都表達MHC II，20%表達PD-L1；而GF小鼠中，MHC II和PD-L1的表達量都顯著降低。

 

PD-1信號通過抑制ThPOK表達來刺激DP IELs的分化

經典CD4+ T細胞和CD8+ T細胞分別靠表達T helper–inducing POZ/Krüppel-like factor （ThPOK）和runt-related transcription factor 3 （Runx3）來維持自身譜系。因此，DP IELs的分化需要Runx3表達量的上調和ThPOK的缺失。此外，IECs上MHC II和PD-L1的表達都對DP IELs的分化至關重要，這表明TCR和PD-1釋放的信號可能參與了CD4+IECs的細胞重編程。前期實驗結果顯示：T細胞內源性的PD-1信號對DP IELs的分化是必需的（圖5A-C）。為了進一步探究其中的分子機制，研究者們使用了ThPOK-GFP報告小鼠。實驗結果顯示：PD-1對ThPOK表達的抑制和DP IELs的分化需要PD-1信號的存在（圖5D-E）。此外，體外實驗結果（圖5G-I）顯示：PD-1信號通過經典的Src homology 2 domain–containing tyrosine phosphatase （SHP） 通路來下調CD4+IECs中ThPOK的表達，從而促進DP IELs的分化。

圖5A-C. （A）C57BL/6野生型小鼠中，PD-1在不同IEL亞群中的表達情況。當SP IELs向DP IELs分化時，PD-1表達量下降。（B）與PD-L1+/+小鼠對比，在PD-L1−/−小鼠小腸中，DP IELs比例明顯下降。（C）將來自于PD-L1+/+小鼠和PD-L1−/−小鼠的脾CD4+ T細胞1:1混合后，移植到RAG-1−/−受體小鼠體內。來源于PD-L1−/−CD4+ T細胞的DP IELs比例明顯降低。

 

圖5D-F. （D）實驗示意圖：將來源于ThPOK-GFP報告小鼠的脾臟T細胞移植到RAG-1−/−受體小鼠體內，并在重建期對受體小鼠進行anti-PD-1抗體處理；（E）ThPOK和Runx3的表達水平；（F）DP IELs的比例。

 

圖5G-I. （G）將CD4+ T細胞和TGF-β、RA、PD-L1體外共培養3天后，測定ThPOKhi細胞比例。PD-L1介導了ThPOK的表達下調；（I-H） 將CD4+ T細胞和TGF-β、RA、PD-L1、SHP抑制劑（SHPi）體外共培養3天后，測定DP IELs的比例以及ThPOK和Runx3的表達水平。

 

綜上，在這篇文章中，研究者們發現IECs是腸道中促進DP IELs分化的重要調控因素，起到了非典型APC的作用。腸道微生物群產生的IFN-γ可通過刺激IECs表達MHC II和PD-L1，對SP IELs提供TCR刺激和共受體信號，促進其向DP IELs分化。此外，研究者們還發現不同生理位置的IECs的基因表達譜會有所區別，而這也會影響它們周圍的組織駐留型免疫細胞（例如DP IELs的分化）。

注：文中所有小鼠均為C57BL/6遺傳背景

 

人體腸道微生物基因組作為人類的第二套基因組，與人類健康密切相關。大量的研究表明腸道微生物與包括心血管、腫瘤、免疫、神經、消化等多種疾病的發生發展密切相關，其因果關系也在逐步闡明中。