目前在腫瘤免疫療法中，阻斷免疫檢查點是最有前景的療法之一。其中，PD-1/PD-L1檢查點是最廣為研究的領域之一。程序性死亡受體1(Programmed cell death protein 1,PD-1)表達于活化T細胞表面，并能傳導免疫信號抑制T細胞的增殖、生存和效應功能，影響T細胞的抗腫瘤效果。PD-1表達上調是T細胞活化的正常結果，也是終止免疫反應所必須的，但其異常高表達會過度抑制T細胞活性，因此維持PD-1蛋白水平在合適范圍內是非常重要的。PD-1的表達是被多層級調控的，目前在翻譯后水平調控方面，已知FBXO38能介導細胞表面的PD-1泛素化并通過泛素蛋白酶體途徑使其降解[1]，但不知道在被轉運至細胞表面前，是否還有調控機制參與胞內PD-1蛋白水平上的調控。此外，PD-1療法還面臨著耐藥性和低響應率的問題。雖然5-FU與PD-1單抗聯(lián)合療法已被臨床前研究數據證明有效，但它的具體機制尚不清楚。

今年10月，北京大學基礎醫(yī)學院王嘉東教授、王巍教授團隊和北京大學人民醫(yī)院申占龍教授團隊聯(lián)合在著名SCI期刊PNAS上發(fā)表了題為“KLHL22 maintains PD-1 homeostasis and prevents excessive T cell suppression”的文章[2]，揭示了一種可在翻譯后水平上調控PD-1蛋白穩(wěn)態(tài)的相關蛋白：KLHL22。它能在PD-1被轉運至T細胞表面前介導其降解；而KLHL22的缺乏可導致PD-1異常高表達，T細胞活性被過度抑制，抗腫瘤反應降低。此外，該文章揭示化療藥物5-FU可通過抑制Klhl22轉錄來提高PD-1的表達量，從而增強5-FU和PD-1單抗聯(lián)合療法的效果。

KLHL22是一種主要的PD-1相關蛋白

為了探究蛋白質水平上PD-1的調控因子有哪些，研究人員首先在穩(wěn)定表達PD-1的Jurkat細胞和HEK293T細胞上進行串聯(lián)親和純化/質譜(Tandem affinity purification,TAP/MS)分析。在這兩種細胞的TAP/MS結果中，他們發(fā)現(xiàn)KLHL22蛋白都得到了較高的特異性富集(>10%)。接下來，他們又做了免疫沉淀(Immunoprecipitation,IP)和免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation,CO-IP)實驗來驗證KLHL22與PD-1間的結合作用，證明KLHL22是能與PD-1結合的蛋白質。

圖1. KLHL22能與PD-1結合

KLHL22缺失導致PD-1蛋白量上升

E3連接酶能特異性識別并泛素化底物，而被泛素化的蛋白質大部分都通過泛素-蛋白酶體途徑進行降解。而KLHL22是E3泛素連接酶BTB-CUL3-RBX1(BCR)復合體的一部分，因此，研究人員首先探究KLHL22能否影響PD-1降解。他們發(fā)現(xiàn)在Klhl22敲低的活化Jurkat細胞中，細胞表面PD-1蛋白水平升高，而PD-1在mRNA水平上并不受影響。此外，在Klhl22敲低的HEK293T細胞上也出現(xiàn)類似結果。為了進一步進行體內驗證，研究人員使用了賽業(yè)生物構建的Klhl22敲除小鼠。研究結果發(fā)現(xiàn)敲除Klhl22并不影響T細胞的發(fā)育、外周穩(wěn)態(tài)和活化。而且雖然編碼PD-1的Pdcd1基因在轉錄水平上并沒有發(fā)生變化，但Klhl22敲除小鼠體內CD8+T細胞和CD4+T細胞表面PD-1蛋白水平上升。這些數據與體外細胞實驗數據一致，說明Klhl22敲低導致了PD-1蛋白量上升。

圖2. Klhl22 WT和Klhl22 KO小鼠CD8+T細胞和CD4+T細胞表面PD-1蛋白水平

KLHL22在PD-1被轉運至細胞表面前介導其降解

為了探究KLHL22介導的PD-1降解發(fā)生在哪個階段，研究人員使用了蛋白轉運抑制劑brefeldin A(BFA)來處理穩(wěn)定表達PD-1的HEK293T細胞。BFA能特異性阻斷蛋白質從內質網到高爾基體的轉運過程。研究人員發(fā)現(xiàn)，在Western Blot結果中，BFA處理組出現(xiàn)了一條代表未完全糖基化的小分子量PD-1條帶，且在Klhl22敲低的細胞中，未完全糖基化的PD-1蛋白比完全糖基化的PD-1蛋白濃度更高。此外，在小鼠模型上也有類似結果：與Klhl22 WT小鼠相比，Klhl22 KO小鼠體內淋巴結CD3+T細胞的高爾基體提取物中，未完全糖基化的PD-1蛋白量明顯升高。這些結果顯示KLHL22與未完全糖基化的PD-1相關。為了進一步驗證這個結論，研究人員利用免疫沉淀實驗檢測KLHL22和未完全糖基化的PD-1蛋白是否能相互結合。結果顯示，對比PD-L1，KLHL22和未完全糖基化的PD-1蛋白有更強的結合作用。此外，熒光檢測共定位結果也表顯示，BFA處理后，伴隨著細胞表面PD-1蛋白的信號消失，胞內PD-1和KLHL22的重疊信號顯著增強。這些數據都說明KLHL22是在PD-1被完全糖基化并轉運至細胞表面前介導其降解。

圖3. Klhl22和PD-1熒光檢測共定位

PD-1可被KLHL22/CUL3/RBX1泛素化

已知KLHL22是BCR E3泛素連接酶的底物特異性接頭蛋白，能特異性識別底物并介導其泛素化。研究發(fā)現(xiàn)，用蛋白酶體(Proteasome)抑制劑MG132處理穩(wěn)定表達PD-1的HEK293T細胞后，細胞內PD-1泛素化水平上升，而Klhl22敲低則顯著降低了PD-1的泛素化水平。此外，免疫沉淀實驗結果表明在CUL3、RBX1都存在的情況下，相比于無處理的對照組以及使用了突變KLHL22Δ6K轉染的對照組，BFA處理加上Klhl22 WT的轉染，能顯著提升了PD-1的泛素化水平。為了進一步確認PD-1泛素化位點，研究人員首先使用了UBPred數據庫來預測PD-1的賴氨酸殘基，并通過泛素化實驗進行確認，發(fā)現(xiàn)了K210和K233這兩個未完全糖基化的PD-1蛋白的泛素化位點。

圖4. KLHL22/CUL3/RBX1復合物能使PD-1泛素化.

KLHL22通過降解PD-1增強腫瘤免疫效果

為了探究KLHL22在腫瘤免疫中的作用，研究人員在Klhl22 KO小鼠和Klhl22 WT小鼠體內分別接種了黑色素瘤細胞。結果顯示，與Klhl22 WT小鼠相比，Klhl22 KO小鼠的腫瘤演進更快，且小鼠存活期更短。此外，Klhl22缺失不影響CD8+T細胞和CD4+T細胞，或是調節(jié)性T細胞(Treg)在腫瘤微環(huán)境中的比例，但腫瘤浸潤CD8+T細胞和CD4+T細胞表面的PD-1水平在Klhl22 KO小鼠內明顯上升，并且能產生IFN-γ、TNF和顆粒酶B的CD8+T細胞和CD4+T細胞數量顯著下降，CD8+T細胞的增殖也受影響。這些結果顯示在Klhl22 KO小鼠的腫瘤微環(huán)境中，CD8+T細胞和CD4+T細胞活性被過度抑制。為了進一步驗證Klhl22 KO是通過PD-1來發(fā)揮作用，研究人員在皮下接種了腫瘤的Klhl22 WT和Klhl22 KO小鼠上進行了抗體阻斷實驗。結果顯示，PD-1抗體的加入顯著抑制了腫瘤增殖，消除了原本存在于Klhl22 WT和Klhl22 KO小鼠間的腫瘤生長差異。這些數據說明KLHL22的缺失能通過上調PD-1表達量使腫瘤浸潤T細胞活性被過度抑制。

圖5. PD-1抗體的加入消除了原本存在于Klhl22 WT和Klhl22 KO小鼠間的腫瘤生長差異

T細胞活化信號和腫瘤微環(huán)境能調控KLHL22的表達量

為了驗證KLHL22能否被TCR激活信號調控從而維持T細胞穩(wěn)態(tài)，研究人員觀察了Klhl22在靜息態(tài)T細胞和活化T細胞的mRNA水平，發(fā)現(xiàn)T細胞活化后，Klhl22的mRNA水平顯著提升。在加入了CD3/CD28抗體刺激的Jurkat細胞中也能發(fā)現(xiàn)相同的現(xiàn)象。此外，在結直腸癌(Colorectal cancer,CRC)患者體內，對比臨近的正常組織浸潤T細胞，腫瘤浸潤T細胞的KLHL22蛋白量大幅減少。這些結果顯示T細胞激活導致的KLHL22表達量上升是一個維持PD-1蛋白水平穩(wěn)態(tài)的機制；腫瘤微環(huán)境中這種機制的破壞是導致PD-1異常高表達和T細胞活性被過度抑制的原因之一。

圖6. 在臨近的正常組織浸潤T細胞和CRC腫瘤浸潤T細胞間KLHL22的表達差異

5-FU通過抑制Klhl22轉錄來提高PD-1表達量

有很多臨床和實驗數據都表明化療藥物（例如5-FU）與PD-1單抗的聯(lián)合治療有協(xié)同效果，但具體機制仍不清楚。為了探究5-FU是否通過調控KLHL22表達從而影響PD-1，研究人員進行了qRT-PCR實驗，發(fā)現(xiàn)5-FU降低了Klhl22轉錄水平的表達，并且可以在不影響PD-1 mRNA的水平上提高PD-1蛋白的表達量，而這種現(xiàn)象只在Klhl22 WT小鼠上出現(xiàn)。并且，5-FU對KLHL22蛋白表達量的抑制，PD-1蛋白表達量的提高呈現(xiàn)劑量依賴性。為了進一步探究5-FU如何影響KLHL22，研究人員進行了螢光素酶報告基因實驗(Luciferase Assay)。實驗顯示Klhl22啟動子上的一個小區(qū)域能有效啟動Klhl22轉錄，且其轉錄活性在經5-FU處理后顯著降低。這些數據表明5-FU能通過抑制Klhl22轉錄來下調其表達量，從而提高PD-1表達量，增強PD-1單抗效果。該機制與來源于CRC患者的臨床數據相符。

圖7. Klhl22調控PD-1蛋白表達量

該文章揭示了胞內PD-1蛋白被轉運至細胞表面之前由KLHL22蛋白介導的調控機制。KLHL22能識別未完全糖基化的PD-1，并介導其泛素化，使其通過泛素蛋白酶體途徑降解，從而維持PD-1在細胞表面的蛋白水平穩(wěn)態(tài)。此外，化療藥物5-FU處理可抑制KLHL22轉錄，提高PD-1的表達量，從而增強PD-1單抗的治療效果。綜上，該研究揭示了翻譯后水平調控PD-1蛋白水平穩(wěn)態(tài)的新機制，也為進一步應用發(fā)展5-FU和PD-1單抗聯(lián)合療法提供了理論基礎。

參考文獻：

[1] X.Meng et al.,FBXO38 mediates PD-1 ubiquitination and regulates anti-tumour immunity of T cells.Nature 564:130–135(2018).

[2] X.A.Zhou et al.,KLHL22 maintains PD-1 homeostasis and prevents excessive T cell suppression.PNAS 117(45):28239-28250(2020).

原文檢索：

[1] KLHL22 maintains PD-1 homeostasis and prevents excessive T cell suppression.

DOI: https://doi.org/10.1073/pnas.2004570117.