機械信號會誘導細胞的各種下游效應，包括對干細胞行為的調節。細胞活動軌跡在機械和化學性能可以精準調整的生物材料基質上具有典型的特征；然而，這些基質中的大多數都不能體現細胞外基質（ECM）的生物復雜性。針對上述問題，來自英國格拉斯哥大學的ManuelSalmeron-Sanchez教授團隊在Advanced Healthcare Materials上發表了題為“Engineered Full-Length Fibronectin–Hyaluronic Acid Hydrogels for Stem Cell Engineering”的研究性論文。作者使用ECM的兩個主要的組成部分，透明質酸（HA）和纖連蛋白（FN）構建水凝膠體系用于機械生物學研究。與典型的FN表面化學吸附不同，該體系包含了與HA共價交聯的全長度FN。無論是水凝膠表面還是內部，都表現出獨立于FN濃度和活細胞培養能力的水凝膠力學性能的控制。


首先，作者使用硫醇化方法制備出一種可結合ECM組成部分的水凝膠。用降冰片烯對HA進行修飾，形成降冰片烯修飾的HA （NorHA）。根據核磁共振（1H NMR）分析，合成的NorHA大約有20%的降冰片烯功能化的單元結構。最終，作者設計合成了一種具有可控制交聯密度和降解性的光學透明FN-HA水凝膠（圖1）。
 

圖1 全長FN-HA水凝膠的制備

為了評估FN在水凝膠中的摻入情況，作者使用化學展開的FN（即使用TCEP暴露硫醇基團）或天然的FN（即不暴露硫醇基團）制備HA水凝膠。水凝膠標記為HA XFN，其中X為加入到水凝膠中的FN濃度，單位為每毫升微克。形成水凝膠后，作者進行了一系列清洗，以去除水凝膠中未交聯的蛋白，然后用免疫染色觀察剩余的FN。同時與作者預期的一樣，在僅含HA的水凝膠的對照組中未檢測到FN（圖2）。


圖2 力學性能可控的FN-HA水凝膠檢測


作者將人骨髓間充質干細胞（MSCs）接種于含有不同數量FN的FN-HA水凝膠上，在不含FN的HA表面的MSCs表現為微小擴散，呈彌漫性肌動蛋白染色，形態圓形。作者只在接種于HA 500FN上的細胞中檢測到FAs，這一發現表明了HA在細胞初始粘附中的重要作用，提供了與整合素無關的HA 0FN和HA 50FN上的早期細胞附著。正如預期的那樣，由于HA沒有上沒有整合素的受體，因此在HA 0FN上的細胞中不會形成FA（圖3）。


圖3 間充質干細胞附著并散布在FN-HA水凝膠


為了研究HA在MSC上附著中的作用，作者進行了早期附著研究（3 h）來觀察細胞表面受體CD44，它是細胞結合HA的主要蛋白之一。作者發現，與FN-HA水凝膠相比，接種在HA 0FN上的細胞產生了更大的CD44簇（通過簇面積測量），并且當CD44簇面積按細胞大小標準化時，這些差異更加明顯。這一正常化是重要的，因為與FN水凝膠相比，HA 0FN水凝膠上的細胞明顯更小。


圖4 HA對MSC通過CD44連接和擴散的影響


YAP已成為細胞對局部機械特性反應的重要標志，起著機械變阻器的作用。YAP/TAZ被認為是機械轉導的主要調節因子，在將外部機械信號（如ECM剛度）轉譯到細胞核和啟動通過細胞核的下游信號傳導中起著至關重要的作用。圖5顯示了接種在HA FN水凝膠上的MSCs的YAP的易位。僅擴散的HA 0FN水凝膠（no FN）中，YAP染色存在于間充質干細胞中，且主要定位于細胞質，而接種于含FN水凝膠（即HA 50FN和HA 500FN水凝膠）上的細胞則呈現細胞質和細胞核均有YAP染色。


圖5 在相同的水凝膠硬度下，隨著FN數量的增加，YAP進入細胞核的易位增加


在對這種新的水凝膠體系進行初步表征后，作者測試了MSCs在包封后是否存活。MSC存活率等于或大于80%，顯示高細胞相容性。結果證實了紫外光觸發巰基反應對3D細胞培養以及FN交聯時的適用性。作者還研究了7天后三維細胞的擴散和YAP易位，盡管在添加和不添加FN條件下，FN-HA水凝膠的縱橫比相似，但細胞內的細胞面積更大。以上結果表明，巰基經UV引發的光交聯封裝后的MSCs存活率表明，該系統可以原位封裝細胞和細胞擴散，也證明了其作為三維微環境的適用性。


圖6 經FN-HA水凝膠包封的間充質干細胞具有較高的生存能力

 
在本研究中，作者展示了一種通過合成降冰片烯功能化的新方法，將全長FN納入天然HA水凝膠并利用它在UV觸發的巰基雙鍵交聯過程中直接共價結合FN。這些水凝膠被制造包含不同數量的FN。力學性能是獨立于FN含量控制的，MSC分別通過CD44與整合素之間的結合對HA和FN做出反應。這些水凝膠可以用于MSC的3D包封和擴散。該材料是一種多功能系統，可作為干細胞2D和3D工程基礎研究的平臺。