小鼠模型已經成為研究基因功能與致病機制、建立人相關疾病模型和評價研發藥物安全性與有效性等生物醫藥研究不可取代的模式動物。轉化醫學研究就是針對來自臨床患者實際問題，通過實驗室包括分子、細胞及模式動物的相關基礎及臨床前研究，最終實現解決臨床所面臨的已知與未知的難題。所以，轉化醫學研究解決問題的思路與策略，就是將臨床問題，通過實驗室基礎研究與臨床前動物實驗研究相結合，再將研究成果最終轉化到臨床實際應用的過程。

如何應用小鼠模型發高質量文章？

應用小鼠模型開展臨床前相關研究，是實現基礎研究轉化至臨床應用的重要橋梁，而要想建立如此至關重要的連接橋梁，構建人源化小鼠模型是臨床前研究必不可少的強有力工具。過去的研究實踐告訴我們，要想發高質量水平的文章，理想的研究策略就是通過從臨床實踐中尋找與發現與疾病發生相關的潛在新基因，構建相應的基因編輯小鼠模型，以研究證實潛在疾病相關基因與人疾病的因果關系及其致病相關機制，從而為建立人相關疾病小鼠模型奠定基礎，也為評價人相關疾病的臨床治療藥物及方法的臨床前研究創造了條件。

再此，我通過分享我們客戶今年發表于國際著名期刊《Circulation》上的高分文章《In Vivo AAV-CRISPR/Cas9-mediated Gene Editing Ameliorates Atherosclerosis in Familial Hypercholesterolemia》成功案例，進一步說明如何應用基因編輯小鼠模型，開展相關基因與疾病相互關系，以及如何通過該基因編輯小鼠模型，評估基因治療疾病有效性等方面的研究思路策略與技術方法。

1.家族性高膽固醇血癥小鼠疾病模型的建立

文章作者首先從家族性高膽固醇血糖臨床純合子患者中（表現為血漿中高膽固醇和低密度脂蛋白升高，以及血動脈粥樣硬化等表型），篩查到低密度脂蛋白受體（LDLR）未知新突變（比如E207X），且在體外細胞實驗中證實，表達突變LDLR基因與其功能改變具有相關性。那么，如何證實該新發現的點突變與家族性高膽固醇血癥與動脈粥樣硬化的因果關系？作者明白，只依賴體外實驗結果是很難具有真正說服力的，因此，作者計劃在小鼠體內復制人LDLR-E207X點突變，以研究該基因新突變與疾病發生的關系。作者找到我們賽業生物尋求幫助，構建LDLR-E207X點突變小鼠模型。我們通過比對人LDLR與小鼠Ldlr基因序列，找到對應人LDLR E207X點突變位于小鼠Ldlr的E208X位置，應用CRISPR/Cas9基因編輯技術，設計相應的gRNA系列及供體DNA，通過顯微原核注射方法，成功構建Ldlr-E208X點突變小鼠模型。研究結果表明，因為該點突變引入終止密碼，導致小鼠Ldlr蛋白表達功能缺失，且該小鼠模型在高脂飲食誘導下出現明顯高膽固醇血癥及動脈粥樣硬化表型。通過構建Ldlr-E208X點突變小鼠模型，作者不僅證實了Ldlr-E208X點突變與臨床患者高膽固醇血癥及動脈粥樣硬化間的因果關系，而且也建立該疾病的小鼠模型。

2.AAV-CRISPR/Cas9基因治療

在此小鼠模型基礎上，作者進一步探索基因修正療法治療該疾病的可能性與效果。應用肝特異性血清型AAV8載體介導的CRISPR/Cas9基因治療技術，通過分別構建肝特異性表達AAV8-Cas9和AAV8-gRNA加正常Ldlr供體的表達載體，采用皮下注射方法治療剛剛出生的Ldlr-E208X點突變小鼠，結果證實，經AAV8-CRISPR/Cas9基因治療后，小鼠體內正常Ldlr蛋白表達出現一定程度恢復，且小鼠的高膽固醇血癥及動脈粥樣硬化表型也都獲得一定程度的改善，表明AAV8-CRISPR/Cas9體內Ldlr修復治療具有一定效果。作者通過從臨床患者中發現可能的新致病基因，到構建點突變小鼠模型，證實該基因點突變與疾病的因果關系，再到證明AAV8-CRISPR/Cas9基因治療，可以緩解疾病表型的驗證，并最終提出了該疾病發生機制與治療假說，即因LDLR E207X點突變，使該基因功能損傷，導致血中LDL含量增加，從而引起高膽固醇血癥及動脈粥樣硬化表型。而借助AAV8-CRISPR/Cas9表達載體修正肝臟LDLR基因功能，具有較低血中LDL作用，從而發揮緩解高膽固醇血癥及動脈粥樣硬化的治療作用。

該文章無論從研究思路與策略，再到技術方法，都為我們今后應用基因編輯小鼠模型，開展相關基因功能研究，疾病模型的建立，以及治療方法及其效果評價提供了非常好的參考借鑒作用。

為什么要構建人源化小鼠模型？人源化小鼠模型有哪幾種類型？

過去人們提起人源化小鼠模型，首先想到是應用免疫缺陷小鼠，移植人細胞或組織，使小鼠體內含人免疫系統的人源化小鼠模型。然而，現在的人源化小鼠模型概念已擴展到包括，應用基因編輯技術，導入人相關基因，或者應用無菌小鼠，移植人腸道微生物等方法實現。所以，所謂人源化小鼠模型，就是指通過移植或基因編輯技術方法，將人細胞組織、人基因或人腸道微生物導入小鼠體內，構建的使小鼠體內含有人相關細胞或組織、基因或腸道微生物等類型的小鼠模型。

為什么要構建人源化小鼠模型？由于人與小鼠作為不同物種，在遺傳學、解剖學、生理病理及代謝等方面雖然有相似性，但也自然有許多不同，特別是其免疫系統存在明顯差異，從而也限制了某些人致病病原體致病機制及抗感染/腫瘤微環境的相互作用等領域的研究，比如HIV病毒、登革熱病毒、肝炎病毒、冠狀病毒等感染人體病毒，小鼠卻完全或非常不易感。通過將人源細胞移植至免疫缺陷小鼠體內，構建人源化免疫系統小鼠模型，使這類小鼠模型成為感染人病毒的易感模式動物，有助于建立人病毒病原體感染研究的小鼠模型。將腫瘤患者腫瘤組織移植免疫缺陷小鼠建立的PDX小鼠模型，也已成為當前臨床腫瘤精準治療的重要策略與技術方法，然而，如何真實反映與評價人源免疫細胞與腫瘤微環境在抗腫瘤免疫治療中發揮的作用，則需要建立更加有效的人免疫反應體系小鼠模型。比如，CAR-T和免疫檢測點抑制劑的抗腫瘤作用是離不開相關免疫細胞的參與，因此，構建含人源免疫細胞系統的人源化小鼠模型，在有效驗證與評估抗腫瘤免疫治療作用中發揮了至關重要的作用。

近年來，抗CTLA-4和抗PD-1抗體作為免疫檢測點（ICP）抑制劑臨床抗腫瘤免疫治療的成功，讓人們看到了此類人源治療性抗體研發的巨大發展前景。由于抗ICP人源抗體是針對人靶點，因此，如果計劃應用小鼠模型，對抗ICP人源抗體的安全性與有效性進行臨床前體內驗證與評估，則需要借助基因編輯技術，比如CRISPR/Cas9或TurboKnockout（賽業生物建立的改良版ES打靶）技術，對小鼠相關抗體靶點基因進行人源化修飾，建立基因編輯的人源化ICP小鼠模型。目前我們也提供相關ICP人源化商品鼠，包括hCTLA-4、hPD-1、hGITR、hVISTA、hOX40、hCD28和hCD39等。

另外，人體腸道微生物組已被認為是人體超級生物體的組成部分，是維持人體生態平衡重要器官之一。近來來，關于腸-腦軸和腸-肝軸概念的提出，已越來越說明，人腸道微生物組成不同及多樣性，直接或間接影響到人體健康及疾病發生發展，以及藥物治療疾病作用。通過移植人腸道微生物組至無菌小鼠，構建人源化腸道微生物的小鼠模型，無疑有助于研究腸道微生物與疾病發生的因果關系、致病機制、藥物治療影響特殊微生物群等相關領域的發展。

BRGSF新型免疫缺陷小鼠特征及其優勢？

通過移植人細胞/組織至免疫缺陷小鼠方法，在小鼠體內重建人源免疫系統，被人們傳統意義上，最早稱之為人源化小鼠模型，而免疫缺陷小鼠則是該類人源化小鼠模型構建的基礎。上世紀60年代初，免疫缺陷小鼠由早期的T細胞缺陷的裸鼠開始、經歷了T細胞和B細胞缺陷的SCID小鼠，T細胞、B細胞和部分先天免疫細胞缺陷的NOD-SCID小鼠，發展到在NOD-SCID遺傳背景基礎上，通過敲除IL-2rg受體，分別構建了更為嚴重免疫缺陷（T/B/NK細胞缺陷）的NOG（2002年）和NSG （2005年）小鼠的重要里程碑階段。另外，在BALB/c遺傳背景小鼠基礎上，通過敲除Rag2和IL-2rg受體，構建與NOG/NSG免疫缺陷相似的BRG小鼠（2005年）。

近年來，為了提高人源髓系細胞在小鼠體內的移植效率，人們又在NOG/NSG小鼠基礎上，引入有利于人源髓系細胞發育成熟的人相關細胞因子，比如GM-CSF、IL-3和SCF等，分別構建了NOG-EXL和NSG-SGM3的改良型免疫缺陷小鼠。雖然，作為NOG/NSG構建基礎的NOD-SCID小鼠，利用了NOD小鼠先天免疫部分缺陷與Sirpa基因變異特征，有利于人源細胞移植的優勢，但NOD-SCID遺傳背景小鼠也存在明顯的先天不足，比如NOD背景小鼠中補體5基因功能損失，導致無法實現補體依賴性細胞毒殺傷作用（CDC）；而SCID背景小鼠又表現對放射性敏感性增加的特性，使其對某些基因毒性藥物更加敏感，并容易發生自發性腫瘤形成的現象。另外，由于NOG-EXL和NSG-SGM3改良型免疫缺陷小鼠引入過表達的人相關細胞因子，使該類免疫缺陷小鼠移植人源細胞后，容易引起小鼠貧血現象，從而縮短了人源化小鼠模型的使用窗口期（一般也只有3～7個月時間）。

BRG免疫缺陷小鼠是基于BALB/c遺傳背景的小鼠，由于其Sirpa基因無法與人單核/巨噬細胞表面的CD47結合，形成“do-not-eat me”現象，因而不利于提高人源細胞移植效率。然而，由于BRG小鼠是直接通過敲除Rag2基因，實現小鼠T/B細胞功能缺陷，從而克服了SCID基因破壞引起的不足。而通過成功引入NOD-Sirpa至BRG遺傳背景的小鼠上，建立的BRGS小鼠，克服了原先BRG 小鼠的不足，大大增加了其移植人源細胞的效率。且在BRGS小鼠基礎上，敲除髓系細胞發育成熟相關的小鼠Flt3基因，成功構建的BRGSF新型免疫缺陷小鼠（2017年）更顯示其獨特的優勢。

與目前同類NOG-EXL和NSG-SGM2改良型免疫缺陷小鼠比較，在人源細胞（比如人CD34+造血干細胞）移植效率方面，特別是人髓系細胞（比如DC細胞），以及人源細胞在小鼠體內有效存活時間等方面，BRGSF新型免疫缺陷小鼠都表現有明顯提高，再加上BRGSF小鼠無補體5及SCID基因的缺失，確保了該免疫缺陷小鼠作為有效評價CDC作用相關策略臨床前研究的可能性。另外，因為沒有采用轉基因技術導入人相關細胞因子（如GM-CSF和IL-3等），也避免由此可能引起的移植小鼠出現貧血現象，使重建的人源免疫系統在BRGSF小鼠體內至少可以維持一年以上，大大提高了人源化小鼠模型的使用效率。

BRGSF小鼠模型是抗體藥物研發、疫苗開發、嵌合抗原受體（CAR）T細胞療法的功效和安全性以及髓系發育研究的寶貴工具。此外，由于在BRGSF植入人造血細胞效率極高，因此它是制備免疫系統人源化（HIS）小鼠以研究和預測人類體內免疫反應的最佳模型。目前，我們賽業生物可為科研與醫藥研發等相關研究領域提供該種BRGSF免疫缺陷小鼠產品及相關技術服務。我們相信，BRGSF新型免疫缺陷小鼠的成功構建，將會極大促進人源化小鼠模型在轉化醫學研究中的應用。

俞曉峰博士 賽業生物高級科學家

國際知名模式動物和細胞生物學專家。1995年于軍事醫學科學院博士畢業后，先后就任于耶魯大學醫學院、iTL基因打靶公司（作為資深科學家負責基因工程小鼠模型研發方案與策略設計）和紐約大學醫學院。2010-2013年期間擔任美國ASC生物技術公司研發部總監、服務部總監以及斯坦福生物技術公司副總裁等職務。目前任職于賽業生物科技，主要負責轉基因鼠及基因敲除鼠平臺的技術工作，其研究成果多次發表在Nature Immunology、Mol Cell Biol等高水平雜志上。